兩種木麻黃變異類型的抗鹽性比較

鄔 金，溫國勝，張汝明，陳嘉琦

（浙江農林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300）

木麻黃（Casuarina equisetifolia）引種栽培于熱帶、亞熱帶地區的濱海疏松沙土中，為多用途速生樹種[1～2]。對于植物逆境的生理適應性研究前人已經進行了深入探討，但有關木麻黃在逆境適應性方面的研究還需要更進一步的探索。鑒于當前浙江沿海防護林建設中高大喬木樹種貧乏，沿海生態環境日益惡化的現狀，篩選抗逆性較強的木麻黃優良無性系，對浙江沿海林業生態建設有重要的理論意義和實用價值。

海岸沙地土壤鹽分較高，含水量較低，且持水力較差，木麻黃能夠在這種惡劣的環境中作為先鋒樹種正常生長繁衍，這與它本身良好的抗逆適應性是分不開的[3]。本實驗將結合丙二醛（MDA）含量和抗氧化酶活性的測定，研究NaCl脅迫下木麻黃的逆境生理響應機制，旨在為浙江省木麻黃的北移馴化篩選優良類型，提供切實的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗地設于浙江省臨安市浙江農林大學東湖校區的平山苗圃，30° 14′ N，119° 42′ E，屬中緯度北亞熱帶季風氣候區，四季分明，氣候溫和，雨量充沛，但晝夜溫差大。多年平均氣溫為15.80℃，其中7月為最熱月，平均溫度為28.10℃，1月為最冷月，平均氣溫為3.40℃，極端高溫為41.90℃，極端低溫為－13.30℃。全年降水量1 628.6 mm，歷年平均日照明數為1 939 h，無霜期234 d。

供試材料為浙江省臺州市玉環縣大鹿島篩選出的兩種木麻黃變異類型。將各變異類型按照樹皮顏色分為黑皮和紅皮，編號分別為B1和R5。于2010年5月將各類型的種子播種在浙江省臨安市浙江農林大學東湖校區的平山苗圃進行培育。選取苗齡1 a長勢優良的木麻黃實生苗的新鮮葉片作為試驗材料。

于2011年9月22日剪取大棚內長勢一致的木麻黃2種變異類型（B1和R5）試驗苗健壯枝條（長度為20 ～30 cm），培養于盛有NaCl溶液的150 mL錐形瓶中，對其進行鹽脅迫處理，NaCl溶液濃度分為6組，分別為0、50、100、150、200和 250 mmol/L（相應的處理號為B11、B12、B13、B14、B15、B16和R51、R52、R53、R54、R55、R56），處理時間共5 d。為防止水分蒸發和植株蒸騰作用導致鹽溶液濃度改變，確保NaCl溶液液面不下降，每隔6 h補充些蒸餾水。分別于處理前1 d（記作0 d，作為對照）和處理后每隔24 h（分別記作1、2、3、4、5 d）取相同生長點部位的葉片進行抗氧化物酶（SOD、POD、CAT）活性和丙二醛（MDA）含量測定，每次測定均重復3次，取其平均值。

1.2 試驗方法

植物抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、過氧化氫酶（catalase，CAT），測定參照陳建勛等方法[4]。SOD活性以抑制氮藍四唑（NBT）光化還原 50%為一個酶活性單位（U）。POD活性以OD470每分鐘的增加1為一個酶活性單位（U）。CAT活性以使OD240每分鐘的減少0.01為一個活性單位（U）。酶活性單位為U/g Protein。

MDA含量：參照李合生[5]的方法（略有改動）進行測定，其含量用μmol/gFW表示。原始數據用Excel 2003和SPSS13.0進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 NaCl脅迫對兩種木麻黃變異類型SOD活性的影響

活性氧在植物體內的清除是由保護酶和抗氧化物質來完成的。SOD是一種具有特定生物催化功能的蛋白質，廣泛存在于自然界中，包括動物體、植物體以及一些微生物體內，它在保護植物抗氧化的作用上起著主要作用[6]。由圖1可以看出，在不同濃度的NaCl溶液處理下，兩種木麻黃變異類型的SOD活性均隨時間的推移呈現先上升后下降，總體趨勢基本一致。

B1的SOD活性在各處理期間均高于對照，從每個處理第1天到第2天迅速升高，并在第2天達到最大值，之后緩慢下降。這說明B1能夠通過增加體內SOD活性來適應NaCl脅迫，且各處理第5天的SOD值均高于對照，幫助消除了NaCl 脅迫帶來的O2－積累，不足以對B1機體產生很大傷害。

R5的SOD活性在各處理期間較對照不盡相同，除了在100 mmol/L的NaCl脅迫處理下，R5的SOD活性于處理第3天達到最大值，在其他處理下R5的SOD活性均于處理第2天達到最大值。在0 mmol/L的NaCl處理第5天R5的SOD活性仍高于對照，這說明R5在0 mmol/L的NaCl處理下可能受到自身營養脅迫，致使其需要通過調節SOD活性來消除營養脅迫產生的機體傷害，而其他濃度的NaCl處理第5天R5的SOD活性均小于對照，這表明R5體內受到NaCl脅迫的傷害加劇，雖然前3天能夠通過增強SOD活性來抵御逆境威脅，但積累的O2－增多，R5體內更容易發生過氧化作用。就SOD活性來說，B1更強，R5變化幅度不大相對穩定。但如果憑靠SOD活性的強弱來判斷抗性強弱是不科學的，有科學試驗證明，單獨提高一種酶的活性，對于植物抗氧化能力的提高影響不太顯著[7]，因此還需要結合POD和CAT兩種抗氧化酶活性強弱來進一步分析。

圖1 NaCl脅迫下木麻黃葉片SOD活性的變化Figure1 Change of SOD activity in leaves of C.equisetifolia under NaCl stress

2.2 NaCl脅迫對兩種木麻黃變異類型POD活性的影響

POD位于非原生質體中，它能減輕環境脅迫產生的過氧化物造成的膜脂過氧化傷害[8]。由圖2可以看出，兩種木麻黃變異類型在不同濃度NaCl溶液處理下的POD活性變化趨勢有明顯差異。B1的POD活性相較對照變化規律基本一致，呈現先降后升再降的趨勢，在0 ～ 150 mmol/L的NaCl溶液處理，于第4天達到最大值；而在200～ 250 mmol/L的NaCl溶液處理下，POD活性均小于對照，說明此濃度的NaCl溶液對B1的脅迫增強。R5的POD活性在0 ～ 200 mmol/L的NaCl溶液處理下均比對照高，變化規律比較一致，呈先降后升的趨勢，其中在0 ～ 150 mmol/L的NaCl溶液處理下于第5天達到最大值；在NaCl溶液處理濃度為200 ～ 250mmol/L的條件下，R5的POD活性呈先升后降的趨勢，并于處理第3天達到最大值，在250 mmol/L的NaCl脅迫下，R5的POD活性在處理第5天低于對照，這可能是由于NaCl脅迫濃度增強使得R5受到嚴重傷害，POD活性受到抑制或被氧化分解。相較于B1，R5的POD活性相對較高。由于超氧化物歧化酶和過氧化物酶都是植物細胞的保護酶，能夠清除H2O2和O2－自由基來保護細胞膜，兩種木麻黃變異類型在不同濃度NaCl溶液處理中SOD和POD活性各有高低，雖然不能立即判斷出哪種類型的抗鹽性更強，但能看到的是，兩種類型均能通過提高SOD和POD活性來抵抗NaCl脅迫對細胞膜的傷害，都具有一定的抗鹽性。

圖2 NaCl脅迫下木麻黃葉片POD活性的變化Figure2 The change of POD activity in leaves of C.equisetifolia under NaCl stress

2.3 NaCl脅迫對兩種木麻黃變異類型CAT活性的影響

CAT主要存在于線粒體和微體中，是清除過氧化氫的主要酶之一[8]。由圖3可以看到，隨著脅迫NaCl濃度的增加，兩種木麻黃變異類型葉片的CAT活性也相應增加。有所不同的是，它們的變化趨勢有明顯差異。如圖3所示，在0 ～ 150 mmol/L的NaCl處理下，B1的CAT活性均一直趨于上升狀態；在200 ～ 250 mmol/L的NaCl處理下，B1的CAT活性均呈現先升后降趨勢，在250 mmol/L的NaCl溶液處理第5天低于對照。而R5的CAT活性在不同濃度NaCl處理下均隨時間的推移呈現正相關趨勢，且都比對照高。綜合來看，R5的CAT活性于處理后期明顯高于B1。這說明在同等脅迫處理條件下，R5比B1要更具抗鹽性，B1在200 mmol/L以上的NaCl溶液中的CAT活性較低，植物體內細胞膜受到的傷害較大。

圖3 NaCl脅迫下木麻黃葉片CAT活性的變化Figure3 Change of CAT activity in leaves of C.equisetifolia under NaCl stress

2.4 NaCl脅迫對兩種木麻黃變異類型MDA含量的影響

由圖4可以看出，整個處理期間兩種木麻黃變異類型葉片中的MDA含量在NaCl脅迫下均呈現上升趨勢，且隨著處理時間的增加和處理NaCl濃度的增加，MDA含量也相應增加。其中，兩種類型在不同濃度NaCl處理下的第1天較對照的MDA含量相差不大，處理第2天MDA含量開始增加，第3天到第5天急劇增加，并均于各處理第5天達到最大值。MDA含量的增加，表明細胞膜脂過氧化程度加強，質膜結構和功能都受到一定程度的損害。隨著NaCl處理濃度的增大，B1的MDA含量逐漸高于R5，表明NaCl脅迫下B1葉片膜脂過氧化較R5嚴重。

圖4 NaCl脅迫木麻黃葉片MDA含量的變化Figure4 Change of MDA content in leaves of C.equisetifolia under NaCl stress

3 結論與討論

植物的細胞質被質膜包裹，質膜是一種由類脂和蛋白質構成的生物膜[9]。細胞質膜具有維持細胞穩定性和選擇透性的獨特功能，植物細胞需要通過質膜才能與外界環境進行物質交換。因此各種不良環境因素都能對細胞產生影響，首先作用的就是細胞質膜[10]。若質膜受到不同程度的傷害，就不能正常進行物質能量代謝，這使得植物體自身構建一定的細胞質膜保護系統。根據質膜保護系統相關的酶活性狀況可以判斷出質膜系統是否受到傷害以及傷害程度。當遭受鹽脅迫時，植物體內的活性氧增加，膜脂過氧化加劇，抗鹽植物通過增強活性氧的清除能力來減輕對細胞質膜的傷害[11]。作為質膜保護系統的主要抗氧化酶，SOD是抵御活性氧傷害的第一道防線，它負責將O2－歧化成H2O2和O2，然后在通過POD和CAT將H2O2清除分解成H2O和O2，使活性氧對植物的傷害降低。張勇[12]等通過對木麻黃無性系水培苗抗鹽性研究得出，在鹽脅迫處理下，POD活性可作為評價木麻黃水培苗抗鹽的主要形狀指標。

本試驗結果表明，在不同濃度NaCl脅迫處理下，兩種木麻黃變異類型B1和R5葉片中的MDA含量明顯增加，表明質膜系統受到了傷害，但抗氧化物酶活性也有相應的增強，說明植物體通過增加酶活性來清除活性氧，為質膜保護系統減免更多的損傷。B1的SOD活性較R5高，而R5的POD活性和CAT活性都比B1高，B1的MDA含量相較R5高，說明B1葉片細胞內O2－更多，比R5受到傷害更大。綜合抗氧化物酶活性和MDA含量測定指標的分析得出，R5比B1更具抗鹽性，這和張勇等的分析結果相符。

木麻黃在鹽脅迫下生理指標表現出的特征，可能與高NaCl濃度產生水分脅迫造成木麻黃生理干旱而導致的傷害[13]。就目前的試驗結果來看，變異類型R5的抗鹽性更適宜進行優良基因的篩選，然而筆者只是從植物生理上做一些初步的探索，為木麻黃的優良變異類型篩選擴散提供一定的理論依據。對于更好的鑒定和篩選具有較強抗寒能力的變異類型或品種，還需要在細胞分子和基因水平上作進一步的研究和分析。

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