PPARα轉基因小鼠在藥物評價中的應用研究

尉明曉，秦 超，陳 威，高 潔，趙顯莉，高 虹

(中國醫學科學院北京協和醫學院實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021)

代謝綜合癥(表現為高血壓、內臟肥胖、胰島素抵抗、脂質代謝異常)的治療是目前醫學界面臨的一大難題。過氧化物酶體增殖激活受體 α(peroxisome proliferators-activated receptor α，PPARα)，參與調控脂質代謝和免疫反應等生理過程，能夠改善代謝綜合征的狀況。因此，近年來，臨床上的PPARα激動劑藥物常被用來進行降血脂的治療。使用PPARα轉基因小鼠進行PPARα激動劑藥物的臨床前評價，建立一種藥效學敏感的動物模型，用于該類藥物的早期篩選，為藥物研發機構節約時間和經費，為人類的臨床用藥提供理論依據。本課題著重探討利用 PPARα轉基因小鼠進行PPARα激動劑藥物的藥效學評價的可行性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

PPARα轉基因小鼠，由中國醫學科學院醫學實驗動物研究所遺傳中心構建，6月齡的C57BL/6小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號 SCXK(京)2012-0001。36只小鼠飼養于SPF級環境中，動物設施許可證號 SYXK(京)2008-0012。飼喂的高脂飼料購自軍事醫學科學院實驗動物中心，飼料配方為:豬油10%，蔗糖15%，膽固醇1%，蛋黃粉10%，膽酸鈉0.1%，基礎鼠料63.9%，飼料合格證:SCXK(軍)-2007-005。

1.2 試劑以及儀器

非諾貝特藥物由北京益民藥業有限公司生產。7100型全自動生化分析儀，日本日立公司產品。

1.3 動物分組以及給藥方法

實驗小鼠總共分為4組。27只PPARα轉基因小鼠隨機分成3組，每組9只，分別為對照組1、高劑量組(非諾貝特60 mg/kg)、低劑量組(非諾貝特30 mg/kg)。人每天用藥物非諾貝特劑量為0.3 g，按照“人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表”，20 g小鼠和70 kg人的交叉匯合處為0.0026，按人的平均體重70 kg計算，小鼠的折合劑量為0.3 g/70 kg×70 kg×0.0026/20 g=39 mg/kg。選取 60 mg/kg作為高劑量，30 mg/kg作為低劑量組，同時設置9只C57BL/6小鼠作為對照組2。每只動物灌胃體積為0.2 mL/10 g體重。各種小鼠在同等的SPF級環境下飼養，自由攝食、飲水。各組動物分別在6周齡時給予高脂飼料喂養一個月，然后連續非諾貝特灌胃一個月。分別于給藥前后檢測動物的肝功能指標、腎功能指標和血脂生化指標(表1)。

表1 實驗小鼠分組及給藥方法Tab．1 The medication method and group of laboratory mouse

1.4 觀察指標與方法

1.4.1 大體觀察

每天觀察一次，觀察指標包括小鼠外觀和行為(包括小鼠的皮膚毛發，眼和黏膜的變化，呼吸，中樞神經系統，四肢活動及其他表現)、分泌物和排泄物等。每周測定小鼠體重。

1.4.2 血生化指標的檢測

4組實驗小鼠在非諾貝特灌胃前、灌胃結束后眼眶靜脈叢取血，留取血清檢測血液生化指標。肝臟功能的指標包括丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬門氨酸氨基轉移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)。腎臟功能的指標包括血尿素氮(BUN)、血清肌酐(SCR)。血脂生化的指標包括膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、游離脂肪酸(NEFA)。

1.5 統計學分析

采用SPSS 12.0統計軟件進行分析，結果以表示，P＜0.05為差異具有顯著性，P＜0.01為差異非常具有顯著性，P＜0.001為差異極其具有顯著性。統計學方法為t檢驗，方差分析，非參數檢驗。

2 結果

2.1 一般體征觀察

整個實驗過程中小鼠的皮膚正常無脫毛現象，眼睛與黏膜無異常分泌物，呼吸平穩，活動正常，無抽搐震顫等異常現象發生。動物給藥后體重變化不大，各組之間的體重沒有明顯差異(P＞0.05)(表2)。

2.2 PPARα激動劑對血生化指標的影響

動物開始給藥前，各組之間的10項血生化指標沒有顯著性差異(P＞0.05)(表3)。①給藥后各組比較:從圖1可以看出，與對照組1比較，非諾貝特各劑量組均能明顯升高CHO(P＜0.05)和HDL-C(P＜0.01)，明顯降低 TG(P＜0.05)。各組之間的體重沒有明顯差異(P＞0.05)。與對照組2比較，非諾貝特各劑量組均能顯著升高 HDL-C(P＜0.01)，顯著降低 TG(P＜0.01)，提示 PPARα轉基因小鼠對該藥物更敏感。②給藥前后各組比較:從圖1可以看出，與給藥前比較，給藥后高劑量組能明顯降低 ALT、AST、ALP、BUN、TG(P ＜ 0.05);能明顯升高CHO、HDL-C(P＜0.01)。而低劑量組能明顯降低ALP(P＜0.05);能明顯升高 CHO、HDL-C(P＜0.05)，但腎功能指標在正常范圍內，沒有臨床意義。結果提示高劑量組的降血脂效果優于低劑量組。給藥前后的血生化指標(表3)。

表2 給藥后小鼠體重變化Tab．2 Change of mouse weight with the medication administration

表3 給藥前后的血生化指標變化Tab．3 Change of serum index with the medication administration

圖1 給藥前后血生化的變化。Fig．1 Change of serum index(ALT、AST、ALP、CHO、TG、HDL-C)with the medication administration．

3 討論

PPARα受體是今年來新發現的一種甾體激素類受體，作為PPARα受體的一個亞型，在脂質代謝、炎癥過程、免疫反應等生理過程中發揮著巨大的作用。PPARα主要分布在代謝活性較高的組織中，如腎、肝、心臟、肌肉組織［1］。PPARα 在肝臟脂質代謝中發揮著巨大的作用。PPARα激動劑圍繞降血脂這一中心功能與臨床上許多疾病有關，比如改善脂質代謝、動脈粥樣硬化、心血管疾病、非酒精性脂肪肝、抗炎、保護血管內皮等作用［2－10］。

代謝綜合癥表現為高血壓、內臟肥胖、胰島素抵抗、脂質代謝異常，它的治療是醫學界面臨的一大難題。PPARα基因參與調控脂質代謝和免疫反應等生理過程，能夠改善代謝綜合癥的癥狀［11］。

轉基因動物具有與人類相似的疾病致病原因、機制的優點，使用其評價的藥物，其結果更加準確。轉基因動物已在抗腫瘤藥物、抗艾滋病藥物、抗肝炎病毒藥物、腎臟疾病藥物的篩選中取得了突破性的進展［12］。本課題著重利用PPARα轉基因小鼠進行PPARα激動劑藥物的藥效學評價。

有文獻報道［13－14］，PPARα 激動劑降低甘油三酯的水平，升高高密度脂蛋白膽固醇成分，能夠誘導膽固醇從巨噬細胞和泡沫細胞里移出。在導致低血糖的長時間的禁食下，脂肪酸從脂肪沉積的部位游走到肝臟，在肝臟它們被攝取，氧化和代謝成酮體，PPARα在這代謝過程中能起到中樞性的作用［15］。本文的實驗結果與文獻報道一致，脂肪酸的下降不明顯可能與灌胃時間為一個月有關，延長灌胃時間可能會出現脂肪酸的下降。關于脂肪酸的下降方面的研究值得我們進一步探討。

與給藥前比較，給藥后高劑量組和低劑量組能明顯升高 CHO、HDL-C，能明顯降低肝功能指標。臨床上高血脂常伴有輕到重度的脂肪肝，引起肝功能指標的上升，PPARα激動劑能夠顯著改善脂肪肝的狀況［10］，在本實驗中給藥后高劑量組能明顯降低ALT、AST、ALP，與文獻報道結果一致。在 PPARα 轉基因小鼠體內，非諾貝特給藥一個月能改善肝臟功能及降血脂作用。

根據本試驗結果提示，PPARα轉基因小鼠與C57BL/6相比，在評價PPARα激動劑藥效學方面比常規C57BL/6小鼠更敏感，是一個新的、敏感的動物模型。

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