不同劑量阿霉素致大鼠局灶節段硬化腎病模型的建立比較

馬曉紅，何立群

(1.上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海 200021;2.上海市中醫臨床重點實驗室，上海 200021)

阿霉素(adriamycin，ADR)注射加單側腎切除為大鼠慢性腎臟病的經典模型，文獻報道顯示ADR的注射劑量、注射途徑各有不同［1－9］，部分劑量不能誘導出腎臟局灶節段硬化(focal segmental glomerular sclerosis，FSGS)的病理改變，有些劑量模型雖然有

FSGS表現，但死亡率達15% ～56%［10］，我們為摸索一個既有FSGS表現，死亡率又低的ADR尾靜脈注射劑量，對不同劑量ADR致大鼠FSGS腎病模型的建立進行了研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級8周齡雄性SD大鼠，144只，體重(200±20)g，由上海西普爾 －必凱實驗有限公司提供，SCXK(滬)2008－0016。實驗大鼠分籠飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心，SYXK(滬)2009－0069，溫度 25°、12 h 光照、45% 濕度的環境中，自由飲水，進食標準普通飼料。

1.1.2 藥物 注射用鹽酸多柔比星，10 mg/支，深圳萬樂藥業有限公司生產，生產批號1012E2。

1.1.3 主要試劑 尿蛋白定量試劑盒、尿素氮試劑盒、肌酐試劑盒(南京建成生物工程研究所提供)。

1.1.4 主要儀器 M5型酶標儀(美國MD公司)，GL－20G－II型高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)。MICROM HM 325輪轉切片機(美國MD公司)，Leica DMIL倒置相差顯微鏡(美國萊卡公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模與分組:取144只SD大鼠隨機分為3組，正常組(n=18)，假手術組(n=18)，模型組(n=18)。模型組行單側腎切除，以2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，備皮，用碘酒、75%酒精消毒手術區后鋪巾，距左脊肋骨1.5 cm處斜向外方切口，暴露腎臟，分離腎周脂肪后，切除左腎，結扎血管，逐層縫合，分別于術后第1周分成六個劑量組3 mg/kg、4 mg/kg、4.5 mg/kg、5 mg/kg、5.5 mg/kg、6 mg/kg，每個劑量組18只，行尾靜脈注射 ADR，每次0.6 mL。假手術組僅作背部切口，剝離左腎包膜，保留腎上腺，逐層縫合，于術后第1周尾靜脈注射等體積生理鹽水，每次0.6 mL。模型組、假手術組于術后第5周再次尾靜脈注射，重復前次劑量。

1.2.2 樣本收集及標本制備

1.2.2.1 收集血清、腎臟標本 ADR第二次注射后1周、4周、8周用代謝籠收集大鼠24 h尿，記尿量及飲水量;ADR第二次注射后2周、4周、8周目內皉取血;ADR第二次注射后8周，2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，取出右側腎臟，稱重，去包膜，于10%甲醛固定備用組織病理切片。

1.2.2.2 標本制備 10%甲醛固定腎組織24 h后，脫水，包埋，切片備HE染色。

1.2.3 檢測指標 檢測模型大鼠生化指標:24 h尿蛋白定量、血清肌酐、血清尿素氮。HE染色觀察腎組織病理。

1.2.4 統計學方法 數據均采用SPSS 16.0軟件包進行統計學分析。計量資料以表示。多組間兩兩比較用單因素方差分析(以P＜0.05為差異進行統計檢驗)。采用 pearson法分析大鼠24 h尿蛋白定量、腎功能、成活率與 ADR注射劑量的相關性。

2 結果

2.1 各ADR注射劑量組大鼠成活率及與ADR注射劑量的相關性

不同ADR注射劑量組大鼠4周、8周成活率隨著注射劑量的升高呈逐漸下降趨勢，4周、8周時4.5 mg/kg組、5 mg/kg組、5.5 mg/kg組、6 mg/kg組成活率低于50%(表1)。

8周時各注射劑量組大鼠成活率與注射劑量呈高度顯著性負相關(圖1，r=0.904 5，P ＜0.01)。

表1 各組各組大鼠成活率比較(單位:%)Tab.1 Comparison of the survival rate among eight groups(unit:%)

圖1 8周大鼠成活率與ADR注射劑量的相關性曲線。Fig.1 The Relativity curve of the survival rate with ADR in eighth week．

2.2 各ADR注射劑量組大鼠24 h尿蛋白定量及與ADR注射劑量的相關性

ADR第二次注射后1周、4周、8周，各 ADR注射劑量組大鼠24 h尿蛋白定量與正常組相比均明顯升高(P＜0.01)(表2)。

8周時各注射劑量組大鼠24 h尿蛋白定量與ADR注射劑量呈高度顯著性正相關(圖 2，r=0.942 9，P ＜0.01)。

2.3 各ADR注射劑量組大鼠腎功能及與ADR注射劑量的相關性

ADR第二次注射后2周、4周、8周，各 ADR注射劑量組大鼠血清肌酐水平與正常組相比顯著升高(P＜0.01)(表3)。

血清尿素氮水平與正常組相比，各ADR注射劑量組大鼠在4周、8周時有明顯升高(P＜0.01);2周時4 mg/kg組較正常組升高(P＜0.05)，3 mg/kg組無統計學意義(P＞0.05)，其余各組明顯升高(P＜0.01)(表 4)。

8周時各注射劑量組大鼠血清Scr與ADR注射劑量呈高度顯著性正相關(圖3，r=0.938 4，P＜0.01);血清BUN與ADR注射劑量呈高度顯著性正相關(圖 4，r=0.956 8，P ＜0.01)。

表2 各組24 h尿蛋白定量水平比較(單位:mg/24 h)Tab.2 Comparison of 24 h upq among eight groups(unit:mg/24 h)

2.4 各組大鼠腎臟外觀變化(彩插2圖5)

肉眼觀察:正常組、假手術組腎臟大小正常，色澤紅潤，表面光滑，腎包膜完整。各 ADR注射劑量組大鼠殘余腎呈腎代償性肥大，色澤蒼白，表面粗糙、布滿顆粒狀隆起，腎包膜不完整，和周圍組織無明顯粘連，殘腎易分離，腎臟外觀的改變隨著 ADR注射劑量的加大呈加重趨勢。

2.5 各組大鼠腎臟病理HE染色(200倍，400倍)(彩插3圖6)

光鏡(HE染色):正常組、假手術組腎小球未見明顯異常，系膜細胞無增生，毛細血管襻開放，血管壁正常，間質無明顯炎性細胞浸潤;各模型組大鼠腎臟可見腎小球增生、肥大、萎縮，上皮細胞空泡變性，腎小球系膜區增寬、系膜細胞明顯增生，腎小球出現局灶節段硬化，硬化區偶有泡沫細胞形成;腎小管輕中度濁腫、擴張，部分小管內可見蛋白管型和紅細胞;腎間質纖維化，可見大量炎性細胞浸潤。隨著ADR注射劑量的增加，腎小球硬化程度有逐漸加重的趨勢。

3 討論

阿霉素(ADR)腎病大鼠模型報道于上世紀80年代［11］，是目前公認的最接近人類腎小球疾病的模型。根據造模方法可分為急性腎病模型和慢性腎病模型，急性腎病模型類似于人類的微小病變型腎病(MCN)，慢性腎病模型則類似于人類慢性腎小球腎炎和局灶節段性腎小球硬化(FSGS)。該模型為目前腎臟病研究領域應用較多的造模方法之一，其腎毒性的發病機制主要有兩個方面:ADR是一種細胞周期非特異性的廣譜化療抗癌藥物，具有強烈的細胞毒作用，可直接損傷腎臟細胞，干擾足細胞的蛋白合成，造成足細胞的改變;其次ADR中的醒式結構在腎臟內還原為半醒型自由基，與氧反應產生活性氧，誘發腎小球上皮細胞脂質過氧化反應，破壞濾過膜，產生蛋白尿。ADR的腎臟病理改變與ADR的產地、給藥途徑、動物品系有密切關系［12］。

圖2 8周大鼠24 h尿蛋白定量與ADR注射劑量的相關性曲線。Fig.2 The Relativity curve of 24 hupq with ADR in eighth week．

表3 各組血清肌酐水平比較(單位:umol/L)Tab.3 Comparison of serum creatinine among eight groups(unit:umol/L)

表4 各組血清尿素氮水平比較(單位:mmol/L)Tab.4 Comparison of serum urea nitrogen among eight groups(unit:mmol/L)

圖3 8周大鼠血清肌酐與ADR注射劑量的相關性曲線。Fig.3 The Relativity curve of rat serum creatinine with ADR in eighth week．

圖4 8周大鼠血清尿素氮與ADR注射劑量的相關性曲線。Fig.4 The Relativity curve of rat serum urea nitrogen with ADR in eighth week．

由于ADR的心肌毒性和腹瀉等副作用極易引起模型動物的死亡，尤其是 ADR的心臟毒性［13］是模型大鼠死亡的主要原因，從而影響了實驗的效果。ADRN模型可模擬人類各種腎小球和腎小管疾病［14－16］，所以我們采用不同注射劑量進行造模，評價不同劑量ADR的腎毒性、毒副作用，分析不同劑量ADR的造模效果，從而摸索出一個相對較優的注射劑量。

我們在實驗中采取單側腎切除加重復尾靜脈注射的方法，分6個ADR注射劑量進行觀察，提示尿蛋白、血肌酐分別于造模后1周、2周出現明顯升高，且呈進行性加重，這個結果與ADR誘發腎小球上皮細胞脂質過氧化反應，破壞濾過膜有關;肌酐升高的同時血清尿素氮也有所升高，24 h尿蛋白、血肌酐、血尿素氮的升高及成活率呈ADR注射劑量依賴。各注射劑量組大鼠腎臟均出現FSGS病理改變，腎小球硬化程度隨著ADR注射劑量的增加呈現出逐漸加重的趨勢，考慮可能為ADR的腎毒性所導致。不同ADR注射劑量組大鼠4周、8周時4.5～6 mg/kg組成活率低于50%，4 mg/kg組的8周成活率為61.1%，成活率的下降可能與ADR的注射劑量及其副作用有關。實驗結果提示:ADR注射劑量越大，FSGS的表現越重，Scr水平越高，腎功能越差;無論從外觀還是腎臟病理，3～6 mg/kg劑量組雖然都能出現FSGS的表現，但4～6 mg/kg劑量組死亡率高。故較之其余劑量組，國產ADR使用3 mg/kg注射劑量成模率高，死亡率最低，同時也符合人類FSGS表現，為ADRN較為理想的注射劑量。

因此，阿霉素腎病大鼠模型是應用較多的腎病經典模型之一，其穩定性及模型的成活率會直接影響實驗結果，而ADRN造模中注射藥物的產地、注射劑量及注射途徑的選擇決定著成模周期及成模率，部分劑量雖能誘導出大鼠腎臟局灶節段硬化，但死亡率較高，部分劑量不能誘導出腎臟FSGS。所以，理想的注射劑量有助于在成模的同時減少動物死亡，避免因死亡率高或成模率低對實驗結果造成的影響，由于國產ADR尾靜脈注射劑量3 mg/kg模型大鼠死亡率低，同時大鼠腎臟病理又能表現出符合人類腎小球 FSGS的改變，是較為理想的造模劑量。

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