腎康注射液對單側輸尿管梗阻大鼠腎間質纖維化的影響

田曉 孟曉華 董科 馮曉明 徐潺 王玉潯 史國輝

(唐山河北聯合大學附屬醫院腎內科，063000)

腎間質纖維化是各種腎臟疾病進入終末期的共同病理損害，采取各種措施阻止腎間質纖維化的發生是臨床防治腎小管間質病變、保護腎功能的重要目標之一。以往對多種中藥單味藥或復方制劑的研究均顯示中藥可能在不同的慢性腎臟病治療中具有改善腎功能、減輕腎間質纖維化的功效。本研究目的在于對于腎康注射液的抗腎臟纖維化作用的探討。

1 材料與方法

1.1 藥品 纈沙坦膠囊由諾華制藥公司提供，腎康注射液由西安世紀盛康藥業有限公司提供。本研究中選用的藥物劑量均為以往相關研究已證實的有效劑量[1-2]。

1.2 主要試劑 第一抗體包括兔抗人轉化生長因子-β1、小鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白。第二抗體為生物素標記的山羊抗兔lgG(ZB 2010)及馬抗小鼠lgG(ZB 2020)，均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。第三抗體為辣根過氧化物酶耦聯璉卵白素(福州邁新生物有限公司)。顯色底物為DAB(福州邁新生物有限公司)。

1.3 動物模型制備與標本收集 雄性SD大鼠36只(SPF級，河北聯合大學實驗動物中心提供)，體質量(270±10)g，隨機分為3組(每組12只)，腎康組：術前1 d及術后給予腎康注射液，20 mL/支，每支內含原生藥6 g，按10 g/(kg·d)，腹腔注射每天一次(08：00—09：00)；纈沙坦組：纈沙坦混懸液30 mg/(kg·d)，每天一次(08：00—09：00)1 mL灌胃；模型組(UUO組)：每天同體積的生理鹽水灌胃。

UUO模型的制備參照文獻[2]方法。各藥物治療組均于術前1 d開始用相應藥物等量灌胃，UUO組以等量自來水灌胃。術后第14天處死各組大鼠12只，心臟取血制備血清，－80℃冰箱保存待測腎功能指標，梗阻側經腎門正切的腎組織用10%中性甲醛溶液固定、常規方法制備切片。

1.4 病理學觀察 病理學觀察腎組織切片行HE染色、免疫組織化學染色，單盲法于光鏡下觀察HE染色切片皮質腎間質炎細胞浸潤、腎小管擴張、萎縮和纖維化等病理改變。

1.5 腎功能測定 腎功能測定采用自動生化分析儀(BECKMANCOUL TERL×20)測定血清肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)及電解質。

2 結果

2.1 大鼠生化指標的變化(表1) 由表1可知第14天時3組大鼠的腎功能及電解質均有升高，但模型組(UUO)升高更明顯，兩個用藥組(腎康、纈沙坦)雖有升高，但更接近正常值，模型組與兩個用藥組(腎康、纈沙坦)腎功能和電解質之間有明顯變化，差異有統計學意義(P＜0.05)，兩個用藥組(腎康、纈沙坦)腎功能和電解質之間沒有明顯變化，差異無統計學意義(P＞0.05)，所有指標中以BUN、Scr、P3+變化最為明顯。

2.2 腎臟病理改變 光鏡下可見(HE)。實驗第14天，模型組腎間質炎細胞呈彌漫性浸潤，局灶性加重，腎小管明顯擴張，上皮腫脹，空泡變性，并出現間質纖維化；而腎康組及纈沙坦組的變化相仿，間質內炎細胞則呈小灶性浸潤，少許上皮細胞腫脹，少部分腎小管輕度擴張，腎間質纖維化明顯較模型組輕。

2.2.1 TGF-β1在腎間質的表達(表2) UUO組：TGF-β1在皮層間質細胞漿中表達增多，小管上皮細胞中也有表達，一直處于較高水平。兩個治療組：TGF-β1在皮層間質細胞中較UUO同期表達有所減少。半定量分析顯示：兩個治療組腎小管間質中TGF-β1表達均低于同期UUO(P＜0.05)，腎康組與纈沙坦組在抑制UUO鼠腎小管TGF-β1表達的作用相似，兩組差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.2.2 α-SMA在腎間質的表達 (表2) UUO組可見α-SMA在腎間質細胞中表達為主，部分腎小管上皮細胞中也有表達，維持較高水平。兩個治療組呈局灶性沉積，半定量分析顯示：腎小管間質中α-SMA表達均低于同期UUO(P＜0.05)，腎康組與纈沙坦組在抑制UUO鼠腎小管α-SMA表達的作用相似，兩組相比差異無統計學意義(P＞0.05)。

表1 第14天3組大鼠腎功能、電解質指標比較(±s)

表1 第14天3組大鼠腎功能、電解質指標比較(±s)

注：與模型組比較，▲ P＜0.05

項目 BUN Scr K+ Na+ cl- Ca2+ P3+ Mg2+ 模型組 24.18±9.86 158.33±19.16 5.11±0.30 140.57±1.75 98.73±0.79 2.33±0.84 2.14±0.30 1.35±0.15腎康組 10.87±2.50▲ 100.00±32.50▲ 5.11±0.17 136.65±4.90 96.77±2.72 2.45±0.16 1.15±0.19▲ 1.20±0.26纈沙坦組 10.89±1.75▲ 108.50±29.04▲ 5.26±0.23 140.22±2.53 98.45±1.89 2.45±0.28 1.16±0.19▲ 1.14±0.37

表2 第14天各組大鼠腎小管間質表達TGF-β1、α-SMA的比較(±s)

表2 第14天各組大鼠腎小管間質表達TGF-β1、α-SMA的比較(±s)

注：與模型組比較，▲ P＜0.05

組別 TGF-β1 a-SMA模型組 2.33±0.82 2.00±0.63纈沙坦組 0.92±0.58▲ 1.00±0.55▲ 腎康組 0.83±0.26▲ 0.67±0.41▲

3 討論

腎間質纖維化是所有慢性腎臟疾病進行性發展的共同通路，是導致慢性腎功能衰竭(CRF)的病理學基礎，尋求其早期可逆因子或防治措施對腎臟疾病轉歸有重要意義[3]。在本研究中，我們分別觀察了腎小管間質細胞轉分化的標志物α-SMA表達、促纖維化因子TGF-β1表達在UUO所致腎間質纖維化中的變化，結果發現腎康注射液可以使腎小管和腎間質α-SMA表達減少，抑制腎小管上皮TGF-β1的表達。我們發現腎康注射液可以明顯改善UUO模型鼠的腎功能，表現為用藥后Scr和BUN水平較模型組明顯降低。這些結果證實腎康注射液在腎臟疾病中確實具有抗纖維化作用。腎康注射液復方中藥注射液，其主要成分為大黃、黃芪、丹參、紅花。方中大黃為主藥可通腑泄濁，具消除水腫，降低血肌、尿素氮，延緩腎小管間質纖維化的功效。大黃不僅能降低血液中尿素氮的水平，改善慢性腎衰竭病人的臨床癥狀，還可使細胞外基質合成減少和降解增加，降低血壓，增加毛細血管的通透性，以及減輕腎硬化，延緩慢性腎衰竭的發生發展[4-5]。黃芪主要含黃芪多糖、氨基酸、蛋白質和大量無機離子，具有擴張血管，降低血壓，加強造血功能，增加腎血流量，調節機體免疫的功能。此外，黃芪可抑制TGF-β1的產生，延緩腎功能惡化，保護腎功能。大黃助胃降濁[6]，黃芪助脾升清，脾胃升降有力，可使腎功能惡化延緩。張東亮等[7-9]在腺嘌呤致腎間質纖維化大鼠動物模型中發現，用復方丹參合劑，可下調TGF-β1的表達，抑制細胞外基質的生成，具有抗腎間質纖維化的作用。通過本實驗可知腎康注射液能抑制單側輸尿管結扎大鼠腎間質中TGF-β1和α-SMA的過度表達，發揮腎臟保護作用[10-12]。綜上所述，腎康注射液可作用于腎間質纖維化的早期，可以通過抑制TGF-β1的活性，減少α-SMA的表達，從而達到其對腎間質纖維化的抑制作用。由于腎康注射液具有療效佳、副作用小等特點，因而對于延緩慢性腎臟疾病向終末期腎功能衰竭發展有一定的臨床指導意義，是一種很有前景的藥物，值得繼續深入研究。

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