SM22α抑制大鼠基質重構相關分子的表達及其在血管肥厚中的意義*

王曉娟， 呂 品， 韓 梅

(河北醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，河北省醫學生物技術重點實驗室，神經與血管省部共建教育部重點實驗室，河北石家莊050017)

血管肥厚、硬化是高血壓所致心、腦、腎等并發癥的主要病理基礎［1］。循環血或局部產生的血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)可刺激中膜血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)發生表型轉化，表現為細胞肥大或增殖，伴有細胞外基質沉積和重構，導致管壁增厚，順應性降低，進而引發高血壓［2］。平滑肌蛋白 22α(smooth muscle protein 22 alpha，SM22α)是VSMCs分化標志物之一，除參與平滑肌收縮和細胞骨架重構外，在VSMCs增殖、血管炎癥及氧化應激過程中也發揮重要作用［3-6］。但其在Ang II誘導的血管硬化中的作用尚不明確。Ang II是已知最強的縮血管活性物質之一，本實驗利用Ang II微滲透泵皮下植入，建立大鼠高血壓模型。分別用含有野生型和突變型SM22α的重組腺病毒感染大鼠頸總動脈，觀察SM22α對血管肥厚和基質重構相關分子表達的影響。

材料和方法

1 動物

清潔級13～16周齡 SD雄性大鼠，由河北省實驗動物中心提供。

2 主要試劑

兔抗SM22α多克隆抗體和兔抗綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)多克隆抗體購自Santa Cruz;兔抗血管細胞黏附分子1(vascular cellular adhesion molecule-1，VCAM-1)多克隆抗體、兔抗細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)多克隆抗體、兔抗基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)多克隆抗體和兔抗基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)多克隆抗體購自Epitomics;免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒購自中杉金橋公司;AngⅡ購自Sigma。

3 主要方法

3.1 GFP標記的重組腺病毒構建 采用腺病毒表達系統(ViraPowerTMAdenoviral Expression System)構建重組腺病毒表達載體。首先利用PCR方法擴增GFP-SM22α使其具備特定的CACC接頭，以連接、轉化、提取質粒等方法克隆入載體pENTR/D-TOPO以獲得入門克隆，經PCR及測序鑒定正確后，用重組酶(LR ClonaseTMⅡ Enzyme Mix)進行入門克隆與表達載體(pAd-CMV/V5-DEST)間的重組，以獲得表達克隆Ad-GFP-SM22α。鑒定后的重組表達載體，用限制性內切酶PacⅠ線性化后感染293A包裝細胞得到重組腺病毒。同樣，將SM22α第181位Ser分別點突變為Asp(D)和Ala(A)后，構建SM22α強制磷酸化突變體Ad-GFP-S181D和SM22α非磷酸化突變體Ad-GFP-S181A的腺病毒表達載體。

3.2 動物模型的制作 雄性13～16周齡SD大鼠，戊巴比妥(50 mg/kg)腹腔注射麻醉。沿頸部正中線切開皮膚及皮下組織，充分暴露頸總動脈。將含有5×1012pfu/L腺病毒的F127凝膠涂在頸總動脈周圍，其中分別導入SM22α、S181D和S181A重組腺病毒，縫合皮膚。3 d后無菌條件下將含有Ang II的Alzet泵(Ang II釋放速度為 750μg·kg-1·d-1)植入大鼠皮下組織，對照組埋植僅灌注有生理鹽水的Alzet泵，縫合切口。術后給予正常飲食，2周后取出Alzet泵停止輸注Ang II，處死大鼠。

3.3 形態學分析 取頸總動脈標本0.5 cm置冷PBS中洗凈殘留血液，放入4%多聚甲醛中固定至少24 h，乙醇梯度脫水，低溫石蠟垂直定向包埋，5μm厚度切片，常規HE染色。并于光鏡下觀察、照相、進行圖像學分析，計算中膜厚度。

3.4 免疫組織化學分析 標本經4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，5μm厚連續切片。免疫組化染色采用SP法:石蠟切片經二甲苯及乙醇脫蠟至水。修復緩沖液 (1.8 mmol/L檸檬酸，8.2 mmol/L檸檬酸鈉)中浸泡，微波抗原修復20 min，自然冷卻。滴加3%過氧化氫孵育10 min，以消除內源性過氧化物酶影響。PBS沖洗3次，每次3 min。滴加山羊血清室溫孵育15 min，進行封閉。傾去血清，滴加適當比例稀釋的Ⅰ抗，37℃ 孵育過夜。PBS沖洗3次，每次3 min。滴加生物素標記的Ⅱ抗，37℃ 孵育15 min。PBS沖洗3次，每次3 min。滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素，37℃ 孵育15 min。PBS沖洗3次，每次3 min。DAB顯色，鏡下觀察，當細胞內出現棕黃色顆粒后用蒸餾水沖洗終止反應，蘇木精復染，常規脫水，透明，封片。鏡下觀察相關抗原的表達變化。采用Image-Pro Morphometric圖像分析系統進行相對定量分析，掃描灰度值用積分吸光度(integral absorbance，IA)表示。

4 統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件處理，計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示，多樣本均數比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 AngⅡ誘導大鼠血壓升高

在給予AngⅡ3 d后血壓明顯升高，至13 d時血壓升高至(181.8 ±7.1)mmHg，3 d、6 d、13 d與對照組比較有顯著差異(P＜0.01)，提示高血壓模型復制成功;頸總動脈感染各種重組腺病毒后血壓沒有明顯變化，見表1。

2 頸總動脈重組腺病毒感染成功

首先利用 PCR方法擴增 GFP-SM22α、GFPS181D和GFP-S181A，見圖2;測序鑒定正確后，采用腺病毒表達系統構建重組腺病毒。大鼠頸總動脈感染以上腺病毒后，對標本進行GFP免疫組織化學染色，見圖3。感染血管壁細胞中均有GFP陽性顆粒，表明腺病毒感染的血管可穩定表達外源基因。

表1 植泵前后大鼠收縮壓測量結果Table 1.Systolic blood pressure with vehicle or Ang II treatment(mmHg.Mean±SD.n=3)

Figure 2.The GFP-SM22α，GFP-S181D and GFP-S181A were amplified by PCR.圖2 PCR方法擴增 GFP-SM22α、GFP-S181D和 GFPS181A

3 SM22α及其非磷酸化突變體抑制AngⅡ誘導的血管中膜肥厚

高血壓模型組 Ad-GFP(+)、Ad-GFP-SM22α(+)、Ad-GFP-S181D(+)和 Ad-GFP-S181A(+)與對照組 Ad-GFP(-)相比中膜厚度分別增加了39.56%、13.00%、43.94%和14.55%。其中 Ad-GFP(+)和Ad-GFP-S181D(+)與對照組比差異顯著(P ＜0.01)，Ad-GFP-SM22α(+)和 Ad-GFPS181A(+)組與對照組比則差異無統計學意義;Ad-GFP-SM22α(+)和 Ad-GFP-S181A(+)與 Ad-GFP(+)組比中膜厚度分別減少了19.04%和17.93%，差異顯著(P＜0.05)。上述結果表明，過表達SM22α及其非磷酸化突變體可抑制血管肥厚，而SM22α磷酸化則無此作用，見圖4。

Figure 3.Representative immunohistochemical staining for GFP of carotid artery sections from different groups(×400).圖3 GFP蛋白在各組血管壁的表達情況

Figure 4.Vascular hypertrophy in rats with HE staining.Mean±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs Ad-GFP(-);#P ＜0.05 vs Ad-GFP(+).圖4 各組大鼠血管HE染色顯示血管壁肥厚情況

4 SM22α及其非磷酸化突變體抑制AngⅡ誘導的MMP-2和MMP-9表達

免疫組織化學染色結果顯示，正常頸總動脈壁細胞中僅有MMP-2和MMP-9的少量表達;高血壓模型組感染 Ad-GFP(+)、Ad-GFP-SM22α(+)、Ad-GFP-S181D(+)和Ad-GFP-S181A(+)分別與正常對照組Ad-GFP(-)比，MMP-2/MMP-9蛋白表達量則分別增加了463.0%/430.0%、34.8%/65.1%、413.0%/460.4%和15.2%/70.2%，其中Ad-GFPS181D(+)和Ad-GFP(+)組與對照組比有顯著差異(P＜0.01)，而過表達SM22α和非磷酸化突變體S181A組與正常對照組比無顯著差異(P＞0.05);感染 Ad-GFP-S181A(+)和 Ad-GFP-SM22α(+)與 Ad-GFP(+)相比，MMP-2/MMP-9表達量分別減少了76.1%/68.9%和79.5%/67.9%，差異顯著(P＜0.05);而 Ad-GFP-S181D(+)與其比無顯著差異(P＞0.05)，見圖 5、6。上述結果表明，過表達SM22α及其非磷酸化突變體抑制MMP-2/MMP-9的表達，而SM22α磷酸化則促進其表達。

5 SM22α及其非磷酸化突變體抑制AngⅡ誘導的ICAM-1和VCAM-1表達

免疫組化染色顯示，正常血管壁細胞中有少量的ICAM-1和VCAM-1的表達;而在高血壓模型血管壁中ICAM-1和VCAM-1的表達升高，Ad-GFP(+)、Ad-GFP-SM22α(+)和Ad-GFP-S181D(+)與正常對照組Ad-GFP(-)比，ICAM-1/VCAM-1蛋白表達量分別增加了 262.5%/315.4%、20.8%/7.7%和291.6%/342.3%，而 Ad-GFP-S181A(+)組無明顯變化，其中Ad-GFP-S181D(+)和Ad-GFP(+)組與對照組比有顯著差異(P＜0.01)，而過表達SM22α和非磷酸化突變體S181A組與對照組無顯著差異(P＞0.05);Ad-GFP-S181A(+)和 Ad-GFP-SM22α(+)與Ad-GFP(+)比，ICAM-1/VCAM-1表達量分別減少了64.4%/74.1%、72.2%/72.2%，差異顯著(P＜0.05)，而Ad-GFP-S181D(+)與其比無顯著差異(P＞0.05)，見圖7、8。上述結果表明，過表達SM22α及其非磷酸化突變體抑制ICAM-1與VCAM-1表達。

Figure 5.Immunohistochemical staining for MMP-2 of carotid artery sections(×400).Mean±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs Ad-GFP(-);#P＜0.05 vs Ad-GFP(+).圖5 MMP-2蛋白在各組大鼠血管壁的表達

討 論

高血壓導致的動脈重塑主要病理表現為血管壁中層平滑肌細胞增生和肥大，基質沉積，血管僵硬，管腔狹窄。本研究用皮下植入含有Ang II的微滲透泵成功制作高血壓模型［8］，在此基礎上，通過頸總動脈局部感染SM22α及其S181位點突變體的重組腺病毒，觀察過表達外源SM22α及其突變體對高血壓血管肥厚的抑制作用。結果顯示，SM22α野生型和S181A非磷酸化突變體可有效抑制感染的頸總動脈的血管肥厚和細胞遷移相關分子MMP-2/MMP-9和黏附分子VCAM-1/ICAM-1的表達。

Ang II是血管緊張素中最重要的組成部分。人體的血管平滑肌上存在有血管緊張素受體，Ang II與其受體結合引起全身微動脈收縮，動脈壓升高［9］。本實驗利用Ang II微滲透泵皮下植入，誘導大鼠血壓升高。并對大鼠頸總動脈進行HE染色，發現血管壁明顯增厚，成功復制了高血壓血管肥厚模型。

VSMCs是血管中膜的主要細胞成份，其表型轉化在高血壓、動脈粥樣硬化及血管成型術后再狹窄等病理過程的發生、發展中起關鍵作用［10］。SM22α是一種重要的VSMCs的分化標志基因，具有組織特異性，僅在平滑肌組織中特異性表達［4-5］。研究證明，SM22α 在 VSMCs的增殖［3］、遷移、血管炎癥［4］及血管氧化應激［6］等方面中起重要作用［11-14］。本研究利用本室構建的Ad-GFP-SM22α、Ad-GFP-S181A和Ad-GFP-S181D腺病毒載體表達系統，感染大鼠頸總動脈觀察過表達外源SM22α及其突變體對血管肥厚和重構相關分子表達的影響。

細胞外基質重構是血管損傷與修復的病理基礎。MMP是降解VSMCs基底膜基質的主要酶類，參與血管基質的重構。其中MMP-2［15］和MMP-9是研究最多的與動脈粥樣硬有關的基質金屬蛋白酶。因此我們可以通過檢測血管中膜MMP-2和MMP-9［7］表達量的變化來確定細胞外基質重構的狀態。本研究利用免疫組化的方法檢測肥厚血管壁中MMP-2和MMP-9的表達情況，結果發現其表達量比對照組明顯增高，該結果與前期資料顯示一致［15］;過表達外源SM22α及其非磷酸化突變體可下調MMP-2和MMP-9表達，而SM22α磷酸化則促進其表達，提示穩定表達的SM22α具有抑制血管基質重構的作用。

研究表明，Ang II與VSMCs上AT1受體結合后，可經多條信號通路，啟動VSMCs表型轉化，增殖狀態的VSMCs合成分泌大量的細胞黏附分子，其中包括ICAM-1和VCAM-1，其表達量的增多是細胞與細胞外基質相互作用和血管重塑的始動環節［16-17］。本實驗進一步觀察在肥厚血管壁中ICAM-1與VCAM-1的表達情況。免疫組化染色顯示:肥厚血管壁中ICAM-1和VCAM-1的表達與對照組相比明顯增高，而過表達外源SM22α及其非磷酸化突變體則抑制ICAM-1和VCAM-1的表達，SM22α磷酸化促進其表達。該結果進一步佐證了SM22α抑制血管重塑的作用。

Figure 6.Immunohistochemical staining for MMP-9 of carotid artery sections(×400).Mean±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs Ad-GFP(-);#P＜0.05 vs Ad-GFP(+).圖6 MMP-9蛋白在各組大鼠血管壁的表達

綜上所述，本實驗以AngⅡ誘導的大鼠高血壓模型作為實驗材料，結果表明，過表達外源SM22α及其非磷酸化突變體可顯著抑制血管肥厚，與抑制基質重構相關分子 MMP-2、MMP-9和黏附分子ICAM-1、VCAM-1表達有關。該發現可為高血壓的防治提供新的理論依據，為血管損傷性疾病的治療提供新的藥物篩選靶點。

Figure 7.Immunohistochemical staining for ICAM-1 of carotid artery sections(×400).Mean±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs Ad-GFP(-);#P＜0.05 vs Ad-GFP(+).圖7 ICAM-1蛋白在各組大鼠血管壁的表達情況

Figure 8.Immunohistochemical staining for VCAM-1 of carotid artery sections(×400).Mean±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs Ad-GFP(-);#P＜0.05 vs Ad-GFP(+).
圖8 VCAM-1蛋白在各組大鼠血管壁的表達情況

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