氧化苦參堿抑制高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及其機(jī)制研究*

劉麗榮， 李 霜， 王圓圓， 石明雋， 肖 瑛， 郭 兵△

(貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院1醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院臨床生化教研室，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，貴州貴陽(yáng)550004)

在糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)展過(guò)程中，腎組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)表達(dá)顯著上調(diào)，主要通過(guò)激活Smads信號(hào)通路，誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，促使細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)合成增加并抑制其降解而過(guò)度沉積，從而造成廣泛的腎組織纖維化［1-2］。Smad7作為抑制性Smad蛋白，可以抑制 TGF-β1/Smads介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)，在多種腎纖維化疾病過(guò)程中，Smad7的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)［3］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，氧化苦參堿(oxymatrine，OM)具有抗肝纖維化［4-5］、肺纖維化［6］、皮膚瘢痕纖維化［7］等作用，但對(duì)DN腎小管間質(zhì)纖維化是否有此作用且作用機(jī)制方面的研究通過(guò)廣泛查閱資料未見報(bào)道。因此，本研究旨在觀察高糖條件下OM對(duì)大鼠近端腎小管上皮NRK52E細(xì)胞TGF-β1及其信號(hào)通路的重要負(fù)調(diào)控因子Smad7表達(dá)變化的影響，探討OM對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小管EMT的作用及其可能機(jī)制，為OM應(yīng)用于DN治療提供重要的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 細(xì)胞

大鼠近端腎小管上皮NRK52E細(xì)胞由復(fù)旦大學(xué)陸利民教授惠贈(zèng)。

2 主要試劑

胰蛋白酶和DMEM培養(yǎng)基(HyClone);胎牛血清(Gibco)，甲叉丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺(Ameresco);抗 TGF-β1、抗 Smad7、抗 α-SMA 和抗 E-cadherin(Santa Cruz);抗 β-actin、DAB、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔和羊抗小鼠IgG(博士德);總RNA提取試劑盒和蛋白質(zhì)marker(天根);BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、MMT細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒(碧云天);PVDF膜、Whatman濾紙(Millinpore Mass);RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas);ECL顯色劑(Pierce);Real-time PCR MasterMix(SYBR Green)(Bio-Rad);real-time PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成，見表1;氧化苦參堿(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為110780-201007)。

表1 引物序列Table 1．Sequences of the primers

3 主要方法

3．1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 復(fù)蘇NRK52E細(xì)胞，于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2恒溫條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%融合時(shí)，換無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液靜止24 h，以使細(xì)胞生長(zhǎng)同步化。細(xì)胞隨機(jī)分組:(1)對(duì)照組(2%FBS+DMEM+5．5 mmol/L glucose);(2)高糖組(2%FBS+DMEM+25 mmol/L glucose);(3)高糖+0．50 g/L OM動(dòng)態(tài)觀察組(2%FBS+DMEM+25 mmol/L glucose+0．50 g/L OM)，上述3 組分別設(shè)2 h、12 h、24 h、48 h 和72 h 五個(gè)培養(yǎng)時(shí)點(diǎn)進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察;(4)高糖+OM不同濃度組(2%FBS+DMEM+25 mmol/L glucose+0.01、0.05、0．10、0．25、0．50 g/L OM)培養(yǎng) 48 h。各組細(xì)胞分別提取蛋白和RNA進(jìn)行檢測(cè)。

3．2 MTT法檢測(cè)OM對(duì)NRK52E細(xì)胞活性的影響 頁(yè)碼 電子書="324" 紙書="2154"/>將NRK52E制成2．5×106/L細(xì)胞懸液，200μL/well接種到96孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合時(shí)，加無(wú)血清DMEM靜止24 h，根據(jù)DMEM中OM濃度不同分為8組:空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、0．01 g/L OM組、0．05 g/L OM 組、0．10 g/L OM 組、0．25 g/L OM組、0．50 g/L OM組和1.00 g/L OM組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后取出96孔板，吸棄上清，每孔加入100μL DMEM和10μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入DMSO 100μL，繼續(xù)培養(yǎng)，直至在光學(xué)顯微鏡下觀察到紫藍(lán)色結(jié)晶全部溶解，在全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上，測(cè)定570 nm處吸光度(以空白對(duì)照組調(diào)零)。

3．3 Real-time PCR 根據(jù)Trizol試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA，核酸蛋白分析儀測(cè)定RNA的濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。取3μg RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行real-time PCR。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，循環(huán)40次。在Bio-Rad CFX 96TM熒光定量PCR分析系統(tǒng)上進(jìn)行，熔解曲線自動(dòng)生成，每個(gè)樣本行3次real-time PCR，以β-actin為內(nèi)參照，目的基因相對(duì)含量以 2－ΔΔCt表示。

3．4 Western blotting 裂解液裂解細(xì)胞，離心取上清，BCA法測(cè)蛋白濃度，加樣緩沖液使蛋白變性，上樣，經(jīng)SDS-PAGE垂直電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜，分別與特異性 TGF-β1抗體(1∶200)、Smad7 抗體(1∶300)、α-SMA 抗體(1∶400)、E-cadherin 抗體(1∶400)和 β-actin抗體(1∶400)4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜，再與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL顯影曝光，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，Quantity One 4．6軟件進(jìn)行分析，以 β-actin為內(nèi)參照，目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平用目的蛋白/βactin灰度比值表示。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 高糖條件下NRK52E細(xì)胞中 TGF-β1、Smad7、α-SMA和E-cadherin mRNA及蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化

1．1 mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化 Real-time PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，高糖組隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，TGF-β1、Smad7和α-SMA mRNA表達(dá)逐漸增高，而E-cadherin mRNA表達(dá)逐漸降低，且呈時(shí)間依賴性(P＜0.05)，見圖 1。

Figure 1．Expression of TGF-β1，Smad7，α-SMA and E-cadherin mRNA in NRK52E cells treated with 25 mmol/L glucose for 2，12，24，48 and 72 h determined by real-time PCR．Mean ± SD．n=3．*P ＜0．05 vs control at the same time．圖1 Real-time PCR方法檢測(cè)高糖條件下NRK52E細(xì)胞中TGF-β1、Smad7、α-SMA和E-cadherin mRNA表達(dá)的變化

1．2 蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化 Western blotting結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，高糖組隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，TGF-β1和α-SMA蛋白表達(dá)逐漸增高，而Smad7和E-cadherin蛋白表達(dá)逐漸降低，且呈時(shí)間依賴性(P＜0．05)，見圖2。

Figure 2．Expression of TGF-β1，Smad7，α-SMA and E-cadherin proteins in NRK52E cells treated with 25mmol/L glucose for 2，12，24，48 and 72 h determined by Western blotting．Mean ± SD．n=3．*P ＜0．05 vs control．圖2 Western blotting方法檢測(cè)高糖條件下NRK52E細(xì)胞中TGF-β1、Smad7、α-SMA和E-cadherin蛋白表達(dá)的變化

2 MTT結(jié)果

1.00 g/L OM對(duì)NRK52E細(xì)胞活性有明顯抑制作用(P ＜0．05)，而0．01 ～0．50 g/L OM 對(duì) NRK52E的細(xì)胞活性無(wú)明顯影響，提示該OM濃度范圍對(duì)NRK52E細(xì)胞活性無(wú)明顯影響，見圖3。

Figure 3．Effects of OM at different concentrations on viability of NRK52E cells detected by MTTassay．Mean ± SD．n=4．*P ＜0．05 vs 0.00 g/L．圖3 MTT法檢測(cè)不同濃度OM對(duì)NRK52E細(xì)胞活性的影響

3 不同濃度OM對(duì)高糖條件下NRK52E細(xì)胞TGF-β1、Smad7、α-SMA 和 E-cadherin mRNA 及蛋白表達(dá)的影響

3．1 對(duì)mRNA表達(dá)的影響 Real-time PCR結(jié)果顯示，高糖作用48 h 后，TGF-β1、Smad7 和 α-SMA mRNA表達(dá)較對(duì)照組顯著增高，E-cadherin mRNA表達(dá)較對(duì)照組顯著降低(P＜0．05);與高糖組相比，高糖+OM不同濃度組隨 OM 劑量增加，TGF-β1和 α-SMA mRNA表達(dá)逐漸降低，E-cadherin mRNA表達(dá)逐漸增高，呈劑量依賴性(P＜0．05)，Smad7 mRNA表達(dá)則 無(wú)明顯差異，見圖4。

Figure 4．Expression of TGF-β1，Smad7，α-SMA and E-cadherin mRNA in NRK52E cells determined by real-time PCR．Mean ± SD．n=3．*P ＜0．05 vs5．5 mmol/L glucose;#P ＜0．05 vs25.0 mmol/L glucose alone．圖4 Real-time PCR方法檢測(cè)不同濃度OM對(duì)高糖條件下NRK52E細(xì)胞TGF-β1、Smad7、α-SMA和E-cadherin mRNA表達(dá)的影響

3．2 對(duì)蛋白表達(dá)的影響 Western blotting結(jié)果顯示，高糖作用48 h后，TGF-β1和α-SMA蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著增高，Smad7和E-cadherin蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著降低(P＜0．05);與高糖組相比，高糖+OM不同濃度組隨OM劑量增加，TGF-β1和α-SMA蛋白的表達(dá)逐漸降低，Smad7和E-cadherin蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng)，且呈劑量依賴性(P＜0．05)，見圖5。

4 0．50 g/L OM 作用不同時(shí)間對(duì)高糖條件下NRK52E 細(xì)胞 TGF-β1、Smad7、α-SMA 和 E-cadherin mRNA及蛋白表達(dá)的影響

4．1 對(duì)mRNA表達(dá)的影響 Real-time PCR結(jié)果顯示，與高糖組相比，高糖+0．50 g/L OM動(dòng)態(tài)觀察組TGF-β1和 α-SMA mRNA 表達(dá)持續(xù)降低，E-cadherin mRNA表達(dá)持續(xù)增高(P＜0．05)，Smad7 mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異;與對(duì)照組相比，高糖+0．50 g/L OM動(dòng)態(tài)觀察組TGF-β1、Smad7和 α-SMA mRNA表達(dá)明顯增高，而 E-cadherin mRNA表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，無(wú)明顯時(shí)間依賴性，見圖6。

4．2 對(duì)蛋白表達(dá)的影響 Western blotting結(jié)果顯示，與高糖組相比，高糖+0．50 g/L OM動(dòng)態(tài)觀察組TGF-β1和α-SMA蛋白表達(dá)持續(xù)降低，Smad7和E-cadherin蛋白表達(dá)持續(xù)增高(P＜0．05);與對(duì)照組相比，高糖+0．50 g/L OM動(dòng)態(tài)觀察組TGF-β1和α-SMA蛋白表達(dá)明顯增高，而Smad7和E-cadherin蛋白表達(dá)明顯降低(P ＜0．05)，無(wú)明顯時(shí)間依賴性，見圖7。

討 論

DN是糖尿病最常見的嚴(yán)重微血管并發(fā)癥之一，已成為導(dǎo)致終末期腎病和糖尿病患者死亡的主要原因，腎小管間質(zhì)纖維化為其主要病理特征。EMT在腎間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，是腎間質(zhì)纖維化發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。TGF-β1是目前已證實(shí)的致腎小管EMT最強(qiáng)的細(xì)胞因子之一，在DN腎組織及高糖刺激的腎小管上皮細(xì)胞中 TGF-β1表達(dá)都顯著上調(diào)［8］，通過(guò)TGF-β1/Smads信號(hào)通路誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，進(jìn)而致腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)生。Smad7作為TGF-β1/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的負(fù)向調(diào)節(jié)因子，能夠阻止或者減弱TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的生物學(xué)效應(yīng)［9-11］。本研究結(jié)果顯示，高糖處理NRK52E細(xì)胞不同時(shí)間后，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，TGF-β1表達(dá)呈進(jìn)行性增高、Smad7蛋白表達(dá)進(jìn)行性降低、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA表達(dá)進(jìn)行性增高、上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)進(jìn)行性降低，提示，高糖一方面可通過(guò)上調(diào)TGF-β1的表達(dá)激活TGF-β1/Smads信號(hào)通路，另一方面通過(guò)下調(diào)Smad7蛋白表達(dá)減弱對(duì)TGF-β1/Smads信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控作用，而誘導(dǎo)NRK52E細(xì)胞EMT的發(fā)生。

Figure 5．Expression of TGF-β1，Smad7，α-SMA and E-cadherin proteins in NRK52E cells determined by Western blotting．Mean ± SD．n=3．*P ＜0．05 vs 5．5 mmol/L glucose;#P ＜0．05 vs 25.0 mmol/L glucose alone．圖5 Western blotting檢測(cè)不同濃度OM對(duì)高糖條件下NRK52E細(xì)胞TGF-β1、Smad7、α-SMA和E-cadherin蛋白表達(dá)的影響

近年研究發(fā)現(xiàn)，OM有免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗心律失常、抗病毒、抗炎、抗腫瘤、抗纖維化等多方面的藥理作用，在抗腎臟纖維化中有很好的療效［12］，但關(guān)于OM是否可以通過(guò)抑制 TGF-β1表達(dá)或促進(jìn)TGF-β1/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路負(fù)調(diào)控因子(如Smad7、SnoN等)的表達(dá)，阻礙 TGF-β1/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制腎小管上皮細(xì)胞EMT，進(jìn)而抑制DN腎小管間質(zhì)纖維化方面的研究國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。基于此，我們假設(shè):OM可以通過(guò)抑制高糖所致的TGF-β1表達(dá)上調(diào)和Smad7表達(dá)下調(diào)，干預(yù)TGF-β1/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的過(guò)度活化，抑制腎小管上皮細(xì)胞EMT，進(jìn)而達(dá)到治療腎小管間質(zhì)纖維化的目的。為此，本研究在體外細(xì)胞分子水平，通過(guò)觀察OM對(duì)高糖條件下NRK52E細(xì)胞中TGF-β1及Smad7的表達(dá)情況，驗(yàn)證上述假設(shè)，以探討OM對(duì)高糖誘導(dǎo)發(fā)生EMT的抑制作用及可能的相關(guān)機(jī)制，為OM用于抗DN腎小管間質(zhì)纖維化治療提供重要的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

Figure 6．Expression ofα-SMA，E-cadherin，TGF-β1 and Smad7 mRNA in NRK52E cells determined by real-time PCR．Mean ± SD．n=3．*P ＜0．05 vs control at the same time;#P ＜0．05 vs high glucose at the same time．圖6 Real-time PCR檢測(cè)0．50 g/L OM對(duì)高糖條件下NRK52E細(xì)胞TGF-β1、Smad7、α-SMA和E-cadherin mRNA表達(dá)的影響

Figure 7．Expression ofα-SMA，E-cadherin，TGF-β1 and Smad7 proteins in NRK52E cells determined by Western blotting．Mean ±SD．n=3．*P ＜0．05 vs control at the same time;#P ＜0．05 vs high glucose at the same time．圖7 Western blotting檢測(cè)0．50 g/L OM對(duì)高糖條件下NRK52E細(xì)胞TGF-β1、Smad7、α-SMA和E-cadherin蛋白表達(dá)的影響

根據(jù)高糖培養(yǎng)48 h的NRK52E細(xì)胞明顯發(fā)生EMT，且 MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示 0．01 ～0．50 g/L OM 對(duì)NRK52E細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用，所以選擇高糖+0．01～0．50 g/L不同濃度OM共同培養(yǎng)NRK52E細(xì)胞48 h，以觀察不同濃度OM對(duì)高糖條件下NRK52E細(xì)胞中各相關(guān)指標(biāo)表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，加OM干預(yù)后NRK52E細(xì)胞中TGF-β1及α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，E-cadherin mRNA和蛋白的表達(dá)增高，Smad7蛋白的表達(dá)增高，且均呈劑量依賴性，提示OM可抑制高糖誘導(dǎo)的 TGF-β1合成分泌增加及Smad7蛋白表達(dá)降低，從而抑制EMT的發(fā)生。因上述劑量依賴性實(shí)驗(yàn)中以0．50 g/L OM的效果最佳，故選擇高糖+0．50 g/L OM進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，行時(shí)間依賴性實(shí)驗(yàn)以期尋找其發(fā)揮明顯抑制EMT效應(yīng)的最佳時(shí)點(diǎn)，結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，高糖+0．50 g/L OM動(dòng)態(tài)觀察組 TGF-β1、α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)明顯增高，而E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低，Smad7蛋白表達(dá)明顯降低而其mRNA表達(dá)明顯增高，在一定時(shí)間范圍內(nèi)無(wú)明顯時(shí)間依賴性;與高糖

組相比，高糖 +0．50 g/L OM 動(dòng)態(tài)觀察組 TGF-β1、α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)持續(xù)降低，Smad7和E-cadherin蛋白表達(dá)持續(xù)增高，E-cadherin mRNA表達(dá)持續(xù)增高，無(wú)明顯時(shí)間依賴性，Smad7 mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異，提示0．50 g/L OM可一定程度地抑制EMT發(fā)生。高糖條件下加OM干預(yù)的NRK52E細(xì)胞中Smad7蛋白水平較高糖組明顯增高，Smad7 mRNA表達(dá)與高糖組均持續(xù)較高水平(兩組間無(wú)明顯差異)，提示高糖條件下Smad7表達(dá)降低并非發(fā)生在其基因轉(zhuǎn)錄水平而是蛋白水平，結(jié)合其它研究結(jié)果［13-15］，推測(cè)其原因可能是:高糖刺激NRK52E細(xì)胞上調(diào)TGF-β1表達(dá)，通過(guò)TGF-β1/Smads信號(hào)通路上調(diào)E3泛素連接酶(如Smurf2、Arkadia等)表達(dá)，介導(dǎo) Smad7蛋白的泛素化降解增強(qiáng)而下調(diào)其蛋白表達(dá)，蛋白水平的降低可能使其基因轉(zhuǎn)錄水平的負(fù)反饋?zhàn)饔脺p弱，從而致使Smad7 mRNA表達(dá)上調(diào)。高糖條件下加入OM后，TGF-β1高表達(dá)受抑制，E3泛素連接酶表達(dá)水平降低，進(jìn)而阻斷Smad7蛋白的降解，因而Smad7蛋白水平增高，而關(guān)于Smad7 mRNA持續(xù)高表達(dá)的機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究探討。綜上所述，OM可抑制高糖誘導(dǎo)NRK52E細(xì)胞發(fā)生的EMT，從體外細(xì)胞分子水平探索其作用機(jī)制，可能與 OM下調(diào) TGF-β1 mRNA和蛋白表達(dá)及上調(diào)Smad7蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路的致纖維化效應(yīng)有關(guān)。