順鉑通過p66Shc-線粒體信號通路誘導人腎小管上皮細胞凋亡

聶 靜， 王懿春， 黎祖榮， 董 靜

(湖南省腫瘤醫院/中南大學湘雅醫學院附屬腫瘤醫院ICU，湖南長沙410013)

順鉑是一種廣泛應用的抗癌藥物。但由于它是細胞周期非特異性藥物，無明確的靶向組織，不良反應也較多。順鉑有嚴重的腎毒性，在臨床中常常引起急性腎功能衰竭。順鉑的腎毒性呈劑量依賴性［1］，因而限制了其臨床治療腫瘤的效果，但目前仍沒有有效且安全的藥物可以運用于臨床，因此研究順鉑腎毒性產生的機制及尋找解決的方法成為了急需解決的課題。目前研究認為其可能的機制包括:細胞凋亡、炎癥反應以及活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的產生等［2］。近年來，順鉑誘導的腎小管細胞凋亡在其腎毒性中的作用逐漸引起了人們的重視，但具體機制仍不清楚。順鉑易于在腎臟外髓的近端小管上皮細胞，特別是S3段蓄積，從而引起急性腎功能衰竭，主要表現為腎小管上皮細胞凋亡［3－4］，同時伴有氧自由基的大量產生，使用抗氧化劑可以降低血尿素氮的水平［5］。我們之前的研究發現人腎小管上皮細胞株HK-2表達p66Shc，高葡萄糖和血管緊張素II均可引起HK-2細胞的p66Shc表達增加及磷酸化，并從胞漿向線粒體轉位，產生大量ROS，導致細胞凋亡［6］。因此本文旨在驗證順鉑是否通過活化p66Shc-線粒體信號轉導通路誘導HK-2細胞凋亡，為今后在臨床上研究如何降低順鉑腎毒性提供新的實驗依據和新的靶分子。

材料和方法

1 主要試劑和儀器

順鉑(山東齊魯制藥廠);DMEM(Gibco);胎牛血清(杭州四季青公司);Bradford蛋白定量試劑盒(Bio-Rad);兔抗人 p66Shc抗體(Upstate Biotechnology);小鼠抗人β-actin抗體 (Santa Cruz);小鼠抗人phospho-p66Shc(Ser36)抗體(Abcam);辣根過氧化物酶Ⅱ抗(中杉金橋);PVDF膜、ECL試劑盒(Millipore);4000MM化學發光成像儀(Kodak);DCFHDA、MitoSOX Red和TUNEL(Invitrogen);激光共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM510)。

2 細胞培養和實驗分組

人源性近端腎小管上皮細胞株HK-2為本室保存。細胞常規培養在含10%胎牛血清的DMEM(Sigma)，當達到80%融合后，將細胞培養在含0．5%血清的培養基12 h，然后用不同濃度的順鉑(10 mg/L和20 mg/L)處理24 h，進行細胞生物學實驗。將細胞分為3組，對照組:穩定轉染pCDNA3．1的HK-2細胞;順鉑組:穩定轉染pCDNA3．1的HK-2細胞給予順鉑作用24 h;順鉑+p66ShcS36A組:穩定轉染p66ShcS36A(第36位絲氨酸突變為丙氨酸的p66Shc)質粒的HK-2細胞給予順鉑作用24 h。

3 實驗方法

3．1 質粒轉染和建立穩定表達的細胞株 HK-2細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養液在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養傳代。待細胞生長至80%融合時，更換為無血清培養基。按Lipofectamine(Invitrogen)說明書進行轉染相關的質粒。培養24 h后，更換含G418(Merk)800 mg/L，當細胞大部分死亡時，換含200 mg/L G418的DMEM完全培養基。采用有限稀釋法進行單克隆化，得到穩定轉染pCDNA3．1或p66ShcS36A質粒的HK-2細胞株。

3．2 激光共聚焦顯微鏡觀察細胞 ROS(DCFHDA)、線粒體ROS(MitoSOX Red)和凋亡(TUNEL)用DCFH-DA熒光染色法測定細胞內的活性氧簇含量。DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，進入細胞內后，被細胞內的酯酶水解生成DCFH;而DCFH不能通透細胞膜，從而使探針很容易被裝載到細胞內，細胞內的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。MitoSox Red是一種高選擇性的檢測線粒體ROS的熒光染料。它可自由透過活細胞膜進入細胞內，并選擇性靶向于線粒體，被線粒體內的超氧陰離子氧化產生紅色熒光。經過順鉑處理后的HK-2細胞加入3．7%多聚甲醛室溫下固定20 min;搖床上用PBS洗3次，每次5 min;分別加入 DCFH-DA、MitoSOX Red和 TUNEL，DAPI復染核，室溫孵育15 min;搖床上用PBS洗3次，每次5 min;激光共聚焦顯微鏡下觀察并照相。

3．3 細胞色素C(cytochrome C，Cyt C)的含量檢測 收集細胞，于冰浴預冷的勻漿緩沖液400μL重懸，移入玻璃勻漿器冰浴中勻漿5 min，勻漿液于4℃、1 000 r/min離心10 min，共2次，取上清于4℃、12 000 r/min離心15 min，收集的上清即為不含細胞核和線粒體的胞漿成分。測定蛋白含量后進行Western blotting分析。

3．4 Western blotting檢測蛋白表達 收集細胞，加入細胞裂解液冰上裂解細胞30 min，12 000 r/min離心15 min，取上清即為細胞總蛋白。用Bradford法檢測蛋白含量，取總蛋白20μg行Western blotting，上樣前樣品與SDS上樣緩沖液混合，于100℃煮沸3 min，經聚丙烯酰胺凝膠電泳(15%)，電轉至PVDF膜上，用封閉液25℃振蕩封閉0．5 h，然后與Ⅰ抗(抗 p66Shc1∶1 000、抗 phospho-p66Shc(Ser36)1∶1 000、抗 Cyt C 1∶200、抗 caspase-9 1∶200 和抗 βactin 1∶400)振蕩4℃孵育過夜，加相應Ⅱ抗孵育1 h，ECL孵育4 min，4000MM化學發光成像儀成像、分析。

4 統計學處理

實驗均重復3次。應用SPSS13．0軟件分析，數據用均數±標準差(mean±SD)表示。組間均數的比較采用單因素方差分析和LSD－t檢驗 ，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 順鉑對p66Shc和第36位絲氨酸磷酸化的p66Shc蛋白表達的影響

Western blotting結果顯示，順鉑處理后p66Shc蛋白表達無明顯改變，但第36位絲氨酸磷酸化的p66Shc蛋白表達增加，且隨著順鉑濃度升高表達逐漸增加(P＜0．01)，見圖1。這說明順鉑誘導 p66Shc第36位絲氨酸磷酸化。

Figure 1．Effects of cisplatin on the protein expression of p66Shc and p-p66Shc in HK-2 cells．Mean ± SD．n=3．＊＊P ＜0.01 vs 0 mg/L;#P ＜0．05 vs10 mg/L．圖1 順鉑對HK-2細胞 p66Shc及第36位絲氨酸磷酸化的p66Shc蛋白表達的影響

2 p66Shc對順鉑促凋亡作用的影響

如圖2所示，對照組僅見少數散在的凋亡細胞(TUNEL探針標記)，順鉑組細胞凋亡明顯增加，可見細胞核固縮，染色質凝聚，染色加深，與順鉑組比較，p66ShcS36A組凋亡細胞顯著減少。這說明順鉑誘導HK-2細胞凋亡，而第36位絲氨酸突變為丙氨酸的p66Shc可以抑制順鉑的促凋亡作用。

3 p66Shc對順鉑促活性氧產生的影響

如圖2所示，與對照組比較，順鉑組細胞ROS(DCFH-DA探針標記)及線粒體ROS(MitoSOX Red探針標記)含量均明顯增加;與順鉑組比較，順鉑+p66ShcS36A組細胞ROS及線粒體ROS含量均明顯減少，表明順鉑促進細胞和線粒體ROS產生，而第36位絲氨酸突變為丙氨酸的p66Shc可以抑制順鉑的促活性氧產生的作用。

Figure 2．Effects of p66Shc S36A on cisplatin－induced production of cellular ROS，mitochondrial ROSand apoptosis in HK-2 cells．Mean ± SD．n=3．＊＊P ＜ 0．01 vs control;##P ＜0．01 vs cisplatin．圖2 p66Shc S36A對順鉑誘導的HK-2細胞ROS、線粒體ROS產生及細胞凋亡的影響

4 p66Shc對順鉑誘導的線粒體凋亡信號通路相關蛋白表達的影響

如圖3所示，順鉑處理后，Cyt C釋放增加，caspase-9蛋白表達也增加(P＜0．01)，p66ShcS36A能阻斷順鉑的上述作用，與順鉑組比較，差異有統計學意義(P ＜0．05)。

Figure 3．Effects of p66Shc S36A on the expression of apoptosis mitochondrial signal transduction pathway－related proteins in HK-2 cells treated with cisplatin．Mean±SD．n=3．＊＊P ＜0．01 vs control;##P ＜0．01 vs cisplatin．圖3 p66Shc S36A對順鉑誘導的線粒體凋亡信號通路相關蛋白表達的影響

討 論

線粒體是順鉑重要的作用靶點［7－8］，順鉑易于在腎臟的近端小管上皮細胞蓄積可能與其在線粒體積聚有關［9］。大量研究證實，順鉑導致腎臟損傷的同時伴有氧自由基的大量產生及腎小管上皮細胞的凋亡，而上述改變與線粒體的損害關系極為密切［10］。p66Shc是哺乳動物生命周期相關的蛋白酶，也是近年來研究細胞氧化應激的主要蛋白酶之一。它通過在線粒體內氧化細胞色素C產生大量H2O2導致細胞氧化損傷，最終引起細胞凋亡［11］。研究表明，抗腫瘤物質萊菔硫烷(D，L-sulforaphane)致人乳腺癌細胞凋亡的作用正是通過p66Shc調節線粒體ROS的產生來實現的［12］。基于以上研究，我們認為順鉑導致的p66Shc介導的線粒體ROS的大量產生可能是導致腎小管細胞凋亡和腎功能受損的主要原因。

首先，我們觀察了順鉑對p66Shc表達、活性的影響，發現順鉑處理后，p66Shc蛋白的表達無明顯變化。有研究認為，第36位絲氨酸(Ser36)是p66Shc介導氧化應激相關損傷的關鍵活化位點［13］。p66Shc主要定位于胞漿，小部分(10% ～40%)與線粒體熱休克蛋白(mHSP70)及線粒體內、外膜轉移酶(TIM/TOM)形成復合物，定位于線粒體膜間隙［14］。在正常情況下，p66Shc是失活的，不影響線粒體的功能，只有在某些信號(p53/H2O2/glucose等)的作用下，胞漿內的p66ShcSer36發生磷酸化，磷酸化的p66Shc可被脯氨酰異構酶PIN1識別從而異構化，然后在蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)的作用下去磷酸化進入線粒體，并最終在線粒體氧化Cyt C產生ROS［13］。因此，我們進一步檢測了順鉑對HK-2細胞p66ShcSer36磷酸化的影響，發現順鉑作用后磷酸化的p66Shc(Ser36)蛋白表達量明顯高于對照組，且隨著順鉑濃度增大，表達增加。說明順鉑誘導HK-2細胞p66ShcSer36磷酸化，可能在順鉑導致的細胞氧化損傷及凋亡中起重要作用。

Ser36是p66Shc活化的關鍵磷酸化位點，當其突變為丙氨酸(S36A)后，p66Shc介導的細胞氧化損傷明顯減輕［13，15］。為了進一步研究 p66Shc在順鉑誘導的細胞凋亡和氧化損傷中的作用機制，我們將表達p66ShcS36A的質粒轉染HK-2細胞。實驗結果顯示，過表達p66ShcS36A可以明顯減輕順鉑誘導的細胞凋亡和氧化損傷。與順鉑組比較，轉染p66ShcS36A可以抑制細胞凋亡，減少細胞和線粒體ROS的產生，減少細胞色素C釋放，下調caspase-9蛋白表達。上述結果提示Ser36磷酸化在順鉑誘導的線粒體凋亡途徑中起重要作用。我們推測在順鉑的作用下，通過磷酸化p66ShcSer36，在線粒體內產生大量ROS，ROS導致線粒體膜通透性轉換孔開放，使線粒體膜通透性下降，從而釋放細胞色素 C，激活胞漿內的caspase-9，最終導致細胞凋亡，上述途徑與p66Shc在H2O2等促凋亡信號作用下的信號轉導通路基本一致［11，13］。

綜上所述，順鉑通過誘導p66ShcSer36磷酸化，使p66Shc轉位至線粒體，在線粒體內產生大量ROS，激活線粒體凋亡通路誘導人腎小管上皮細胞凋亡。