運動聯合紫杉醇對小鼠乳腺癌移植模型荷瘤生長影響的研究

李素萍，矯 瑋

1.Hanshan Normal University，Chaozhou 521041，China；2.Beijing Sport University，Beijing 100084，China.

乳腺癌嚴重威脅女性健康，其防治一直是研究的熱點。隨著醫學模式的演變，乳腺癌的治療觀念也在不斷更新。為了降低乳腺癌患者的死亡率、提高生存率，并力求維持患者身體的完整性，改善其生存質量，人們一直在努力尋找新的治療手段。現在，人們逐漸認識到乳腺癌不僅是一種“慢性病”，也是一種“生活方式病”。對于糖尿病、高血壓等慢性疾病，運動在其防治中作用突出［11］，目前也有研究發現，運動在乳腺癌的預防、臨床治療后的康復中有積極作用［10，14，24］。然而，鑒于癌癥的特殊性和復雜性，有關運動對乳腺癌的治療有何影響，鮮有相關研究。運動可以加速血流速度，以往人們擔心運動同樣也會加速腫瘤組織的血液供應，使得瘤細胞增殖加快，加上癌癥患者本身體能下降，因此，正處在治療期的乳腺癌患者能否進行運動，學界一直持謹慎態度。如果這些患者可以運動，應該以什么樣的方式、強度，以及頻率去運動，都是困惑學界的問題。近年，有研究報道，有氧運動可以使乳腺癌組織的微環境“正常化”［16］，這啟示我們，癌細胞微環境的正常化或許可以影響乳腺癌細胞的生長；運動或許可以作為傳統療法的輔助手段，在乳腺癌的治療中起一定的作用。

紫杉醇是針對G2晚期、M期的特異性藥物，可干擾微管蛋白質的合成，抑制細胞正常有絲分裂的紡錘體形成，將細胞周期阻斷在G2和 M期，導致癌細胞的死亡［5］。NF－κB的過度激活不僅能保護惡變細胞免受凋亡，從而促進腫瘤形成，還能促進癌細胞增殖。NF－κB的異常活化是乳腺癌發生、發展的重要病理、生理機制，這也是當前乳腺癌治療的一個熱點。規律的中等強度鍛煉能降低與年齡有關的 NF－κB活性和p50、p65亞基的表達［21］，運動能否調節乳腺癌細胞NF－κB的活性？能否增強抗癌藥物的療效？本研究通過制備4T1小鼠乳腺癌模型，施予規律的有氧運動、紫杉醇的單獨及聯合干預，以NF－κBp65、細胞凋亡為觀測點，研究運動及其與紫杉醇聯合使用在乳腺癌治療期的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和細胞株

1.實驗動物

SPF級BALB／c小鼠（6～8周齡，雌性），購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證編號：SCXK（京）2006－0009。小鼠飼養在北京市腫瘤防治研究所動物房（屏障環境），許可證號：SYXK（京）2011－0015。小鼠每籠4只群養，自由攝食、飲水，室溫22℃～24℃，濕度50%±10%，人工12／12晝夜節律光照。每3天更換一次鼠料及清理飼養籠具。

2.細胞株 ：4T1小鼠乳腺癌細胞，購自中國科學院細胞庫，按常規貼壁細胞的培養方法培養，收集細胞后，用1640培養液洗滌2次，臺盼藍實驗證實細胞活力≥95%，用1640培養液調整活細胞濃度為4×105／ml，備用。

1.2 主要儀器設備

SLY－RTML六道動物跑臺、OLYMPUS IX51倒置顯微鏡、日本AIRTECH超凈工作臺、HERA cell 150CO2細胞培養箱、BD FACS Calibur流式細胞儀。

1.3 主要試劑

紫杉醇注射液（北京協和藥廠）、ANXN V FITC APOPTOSIS DTEC KIT I（美 國 BD 公 司 ）、NFκB p65 抗 體（BS1253）和IκB－α抗體（BS3601）（美國 Bioworld公司）、PIκBα抗體（9246）（美國 CST 公司）。

1.4 乳腺癌皮下移植模型的制備

碘伏消毒小鼠接種部位，用1ml注射器吸取4T1細胞懸液0.2ml（含有0.8×105個細胞）接種于小鼠右腋皮下，當腫瘤大小2mm×2mm時，判斷為模型建立成功［8］。

1.5 動物分組及干預方案

小鼠購入安靜飼養3天后，按體重隨機分為正常對照組（N，8只）和模型組（64只）。模型組接種4T1乳腺癌細胞，建立小鼠乳腺癌模型。造模期間，運動干預組以7m／min的速度進行適應性跑步。建模成功后，按體重分為生理鹽水組（C）、紫杉醇組（P）、運動組（E）和聯合組（EP），共4組，每組16只（實驗結束時，隨機取8只用于指標測試，其余用于生存期的觀察）。各組之間體重沒有顯著性差異（P＞0.05）（表1）。P組和EP組小鼠腹腔內注射紫素（紫杉醇注射液，PACLITAXEL INJECTION，產品批號：110401，無色至淡黃色澄明黏稠的液體，規格為5ml：30 mg，北京協和藥廠，批準文號：國藥準字 H10980069），劑量為20mg／kg／w［23］，C組和 E組小鼠每周按體重腹腔內注射等體積生理鹽水。E組和EP組小鼠以17m／min的速度（中 等強度）持 續運動［12］，跑臺坡 度為0°，運動 30 min／次，5次／周，共5周。在小鼠運動中不進行電刺激。

表1 本研究干預前各組小鼠的體重一覽表Table 1 Body Weight of Mouse in Different Group before Experiment （X±S）

1.6 測試指標

每周用游標卡尺（精度0.02mm）測量荷瘤的最長徑和最寬徑各2次，處死小鼠前測量1次最長徑和最寬徑。按照公式［19］：V＝0.52×a×b2（a為荷瘤最長徑，b為與a垂直的最寬徑）計算荷瘤體積。第5周干預結束后24h，各組隨機選取8只小鼠，處死小鼠后剝離瘤體，仔細去除瘤體表面的增生血管、被膜等結締組織后，稱重（g），分為兩份，一份制成單細胞懸液，采用Annexin V－FITC／PI復染法對荷瘤組織細胞的早期凋亡和晚期凋亡比例進行檢測［7］。其實驗原理是，在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）分布在脂質雙分子層的內側。在細胞發生凋亡的早期，細胞膜首先發生翻轉，磷脂酰絲氨酸由脂膜內側翻向外側，磷脂酰絲氨酸能與AnnexinⅤ發生特異性結合［7］。因此，Annexin V被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一，而AnnexinⅤ不能穿過細胞膜，因此，正常細胞不能夠被AnnexinⅤ染上顏色。PI為核酸熒光染料，不能透過正常的細胞膜，只能進入已經破損的細胞膜，但在凋亡的中晚期細胞和壞死細胞，PI能夠通過細胞膜而使細胞核紅染。因此，將Annexin V與PI匹配使用，就可以定量分析凋亡細胞和壞死細胞。

另一份采用Western blotting實驗檢測荷瘤小鼠荷瘤組織中 NF－κBp65、IκBα和 Phospho－IκBα的表達，具體方法如下：

1.配膠：根據目的蛋白的分子量，配制12%的分離膠，5%的濃縮膠。

2.上樣：每孔的上樣量為10μl，蛋白量為20μg。

3.電泳：樣品通過濃縮膠時恒壓90V，約20min；當溴酚藍進入分離膠后，電壓改為160V，通過預染蛋白marker來確定電泳停止時間。

4.轉膜：采用濕轉法。300mA恒流，使用0.45μm孔徑的 NC 膜，轉 膜 時 間：IκBα轉 膜 30min，P－IκBα轉 膜 40 min，NF－κBp65轉膜1.5h。轉膜完成后，用麗春紅S染色液對膜進行染色，觀察轉膜效果。

5.封閉：將膜完全浸沒在3%的BSA－TBST中，室溫輕搖1h。

6.一 抗孵育：用3%的 BSA－TBST 稀 釋 一 抗，NF－κBp65和IκBα稀釋比例為1∶2 000，P－IκBα稀釋比例為1∶1 000，GAPDH稀釋比例為1∶5 000。室溫孵育10min，放4℃過夜。

7.洗膜：第2天從4℃冰箱中拿出膜，在室溫孵育30 min。棄去一抗，用TBST洗膜3次，每次10min。

8.二抗孵育：用5%的脫脂奶粉－TBST稀釋 HRP標記的二抗，稀釋比例為1∶10 000，室溫輕搖40min。

9.洗膜：棄去二抗，用TBST洗膜3次，每次10min。

10.顯色反應：將ECL加到膜上后反應3～5min，膠片曝光10s～5min（曝光時間隨不同光強度而調整），顯影2min，定影。用自來水沖洗，去除殘留的定影液后，室溫晾干。

1.7 統計學處理

數據結果以平均數±標準差（X±S）表示，利用SPSS 13.0軟件對數據進行統計分析。采用單因素方差分析，數據齊性用Tukey，不齊時采用Tamhane’s。生存時間采用Kaplan－Meier分析，用Log Rank檢驗進行兩兩比較，顯著性水平定在0.05和0.01。

2 結果

2.1 不同干預手段對4T1乳腺癌模型小鼠瘤重與瘤體比的影響

EP組的瘤重和瘤體比小于C組的瘤重和瘤體比，有顯著性差異（P＜0.05），其他各組和C組相比，雖然瘤重和瘤體比都低于C組，但均無顯著性差異（P＞0.05，表2），提示運動聯合紫杉醇有較好的控瘤效果。

表2 本研究運動、紫杉醇及聯合干預對4T1乳腺癌模型小鼠瘤重、瘤體比的影響一覽表Table 2 Tumor Weight and Ratio of Tumor Weitht and Body Weight in 4T1Mouse in Different Group （X±S，n＝8）

2.2 不同干預手段對4T1乳腺癌模型小鼠荷瘤體積的影響

在第1周開始干預前，各組小鼠荷瘤體積無明顯差異（P＞0.05），符合實驗要求（圖1）。在前2周，各組荷瘤體積增長緩慢。2周后，小鼠的荷瘤體積迅速增長，到實驗結束時，C組小鼠荷瘤體積最大，和C組相比，EP組的荷瘤體積縮小，差異顯著（P＜0.05，表3），提示運動聯合紫杉醇對荷瘤的增長有一定的抑制作用。

表3 本研究運動、紫杉醇及聯合干預對4T1乳腺癌模型小鼠荷瘤體積的影響一覽表Table 3 Changes of Tumor Volume in 4T1Mouse in Different Group （X±S，n＝8）

圖1 本研究運動、紫杉醇及聯合干預對4T1乳腺癌模型小鼠荷瘤體積的影響示意圖Figure 1. Comparison of Tumor Volume of 4T1Mouse in Different Group

2.3 不同干預手段對4T1乳腺癌模型小鼠生存時間的影響

P組和C組相比，中位生存時間的差異具有顯著性（P＜0.05），說明紫杉醇可以延長荷瘤小鼠的存活時間（表4、圖2）。E組、EP組和C組相比，差異非常顯著（P＜0.01），說明荷瘤小鼠以17m／min的速度運動，能延長其存活時間。EP組與P組和E組相比，其延長生存時間的差異也非常顯著（P＜0.01），提示中強度運動聯合紫杉醇對延長荷瘤小鼠的存活時間有較好的效果。

表4 本研究運動、紫杉醇及聯合干預對4T1乳腺癌模型小鼠中位生存時間的影響一覽表Table 4 The Median Survival Time in 4T1Mouse in Different Group （n＝8）

圖2 本研究不同干預手段下的乳腺癌小鼠的生存曲線示意圖Figure 2. Comparison of Survival Time of Mouse in Different Group

2.4 不同干預手段對4T1乳腺癌模型小鼠荷瘤組織細胞早、晚期凋亡的影響

與C組相比，EP組早期凋亡比例增加，有顯著性差異（P＜0.05），其他各組間相比，則無顯著差異（P＞0.05）（表5）。與C組相比，EP組晚期凋亡比例增加非常顯著（P＜0.01），與P組相比，EP組晚期凋亡比例增加顯著（P＜0.05），其他各組間相比，無顯著差異（P＞0.05，圖3）。

表5 本研究運動、紫杉醇及聯合干預對4T1小鼠荷瘤組織細胞早、晚期凋亡的影響一覽表Table 5 Proportion of Early and Late Apoptosis of Tumor Cell in 4T1Mouse in Different Group （X±S，n＝8）

2.5 不同干預手段對4T1乳腺癌模型小鼠荷瘤組織NF－κBp65、IκBα和 Phospho－IκBα蛋白光密度值的影響

與C組相比，EP組NF－κBp65的表達下降，差異非常顯著（P＜0.01），其他各組與C組相比無顯著差異（P＞0.05，表6）。各組IκBα的表達無顯著差異（P＞0.05）。與C組和P組相比，E組、EP組的Phospho－IκBα的表達下降，差異非常顯著（P＜0.01），提示運動對 Phospho－IκBα的表達有一定的下調作用（圖4）。

表6 本研究運動、紫杉醇及聯合干預對4T1模型小鼠荷瘤組織 NF－κBp65、IκBα和Phospho－IκBα蛋白光密度值的影響一覽表Table 6 Optical Density Value of NF－κBp65、IκBα and Phospho－IκBαin 4T1Mouse in Different Group （X±S，n＝6①因試劑昂貴，每組測試了最少有效數6只。）

3 討論

瘤重、瘤體比與荷瘤體積均反映荷瘤生長的情況。有關運動對荷瘤生長影響的相關研究目前較少，Sasvari認為，每天1h的10周規律運動可以減緩S－180肉瘤的生長［22］。從本實驗結果看，干預結束時，模型各組小鼠的瘤體平均重4.42g，瘤體最大的在C組，達5.66g；最小的在EP組，為2.88g。各干預組的瘤重、瘤體比均小于C組，但除EP組外，其他各組和C組相比，瘤重和瘤體比降低均無顯著性差異。從荷瘤體積來看，各干預組小鼠荷瘤的體積均小于C組，但只有EP組小鼠的荷瘤體積減小差異顯著，提示17m／min的中強度運動聯合紫杉醇對荷瘤的生長有明顯的抑制作用，而運動、紫杉醇的單獨干預對荷瘤的生長則沒有明顯的抑制作用，說明運動可以提高紫杉醇的療效。中強度運動聯合紫杉醇能較好的控制瘤體的增長，這可能與運動改變了紫杉醇在小鼠體內的分布有關［6］，運動對紫杉醇在體內的分布產生了有利影響，使得較多的紫杉醇在荷瘤組織中聚集、可以對瘤細胞充分發揮其藥效。

圖3 本研究流式細胞儀檢測4T1模型小鼠荷瘤組織細胞早、晚期凋亡的比例示意圖Figure 3. Comparison of the Proportion of Early and Late Apoptosis of Tumor Cell in 4T1Mouse

圖4 本研究各組小鼠荷瘤組織NF－κBp65、IκBα和Phospho－IκBα的 Western blotting蛋白條帶示意圖Figure 4. Western Blotting of NF－κBp65，IκBα and Phospho－IκBαin 4T1Mouse

本研究發現，單純的運動并沒有促進荷瘤的增長，提示運動并不會導致瘤細胞快速增殖。結合生存時間看，E組小鼠的生存時間顯著長于C組，這提示乳腺癌荷瘤小鼠進行17m／min的中強度運動有助于其“帶瘤生存”。

研究表明，無論是單藥還是聯合用藥，紫杉醇治療乳腺癌都有較好的療效，紫杉醇單藥用于一線治療晚期乳腺癌的有效率為32%～60%［18］。在本研究中，P組沒有表現出很好的控瘤效果，其原因可能是，臨床上紫杉醇的使用方法為靜滴［5］，而對于小鼠，靜滴或靜脈注射給藥比較困難。小鼠尾靜脈非常細小，加上紫杉醇在水中的溶解度極小，臨床現行使用的紫杉醇注射液多使用聚氧乙烯蓖麻油來增加紫杉醇的水溶性。如果給小鼠進行靜脈注射紫杉醇注射液，很容易導致小鼠尾靜脈壞死，故本研究采用了腹腔注射的方法，因此，本實驗中紫杉醇的藥效可能沒有最大程度地發揮。

乳腺癌模型動物的生存時間受動物品種、腫瘤細胞系、運動方式、運動強度、運動持續時間、抗癌藥物等多種因素的影響。Jones等認為，8周的跑臺運動聯合多柔比星對乳腺癌裸鼠有影響［15］，雖然該實驗也是采用的跑臺運動，運動強度也和本實驗基本一致，但該實驗選用的是裸鼠，其結果是只有多柔比星組能夠顯著提高荷瘤裸鼠的存活時間，而運動組和運動聯合多柔比星組均未能顯著提高乳腺癌裸鼠的存活時間，與本實驗結果不一致。這可能和裸鼠沒有免疫力，運動無法提高其自身免疫機能有關。

本研究中的生存時間是從給小鼠接種瘤細胞當天開始，到干預結束時各組小鼠的存活時間。在記錄截止時，EP組有4只小鼠仍存活，其他組的小鼠都已死亡。通過Kaplan－Meier分析顯示，EP組小鼠的生存率最高，且干預各組與C組相比，其平均生存時間均延長，說明紫杉醇、17 m／min的中強度運動、紫杉醇聯合運動均能延長乳腺癌小鼠的存活時間。EP組與P組相比，其延長生存時間的差異非常顯著，說明在使用藥物的同時結合運動能起到了更好的效果。

Schipper認為，對于癌癥，有效的治療有時并不需要腫瘤的完全消退，機體的反應對癌癥治療最為重要［4］。從本實驗結果看，適量運動雖然不能完全消除癌細胞，但是可以提高荷瘤小鼠的存活時間。

研究表明，影響凋亡的因素與腫瘤的發生、發展密切相關。細胞凋亡對腫瘤的生長起負調控作用，腫瘤的生長不僅與細胞增殖速度高有關，還與細胞死亡速率下降有關。在腫瘤細胞的增殖過程中，瘤細胞的凋亡常常被抑制，通過細胞凋亡途徑誘導腫瘤細胞死亡，已成為當前腫瘤研究的熱點之一。

有關運動與細胞凋亡的研究目前大多集中在運動與骨骼肌細胞、心肌細胞、肝細胞、淋巴細胞的凋亡［2，13，20］，運動與腫瘤細胞的凋亡研究較少。本研究發現，單純的運動和紫杉醇干預對乳腺癌小鼠體內癌細胞的增殖和凋亡作用不顯著，這可能與選擇的癌細胞惡性程度高有關，而17 m／min的中強度聯合紫杉醇可以顯著促進癌細胞早期凋亡和晚期凋亡的發生，這可能與17m／min的運動調節了NF－κB的活性有關。

在乳腺腫瘤組織中普遍存在NF－κB激活現象，在乳腺癌的發生、發展及轉移中具有重要作用［17］。調控 NF－κB的活性對于抑制腫瘤生長是一種有效的治療策略。目前，人們試圖使用蛋白激酶抑制劑、免疫抑制劑等，從NF－κB激活的關鍵環節阻斷其激活過程，以阻斷NF－κB對抗凋亡基因、生長、轉移等基因的調控，從而達到抑制甚至消滅腫瘤的目的［1］。由于NF－κB在真核細胞中廣泛存在，它在免疫和其他防御應答中同樣至關重要，事實上，也不能長時間阻止NF－κB的激活，因為，通過藥物對NF－κB進行直接調控有很大的副作用。NF－κB在細胞中廣泛存在，使用NF－κB抑制物有可能對正常細胞產生損害，尤其是B、T淋巴細胞［17］，因此，尋找能適度調控 NF－κB活性的手段在乳腺癌的治療中有重要的意義。

運動可以調節NF－κB的活性，但其作用與運動強度、持續時間、運動頻率等有關。有研究認為，不管是離心、向心還是平坡運動，急性運動都能激活 NF－κB信號通路［3］，而長期有規律的有氧運動會降低NF－κB的活性［21］。本實驗發現，17m／min的中強度運動能顯著下調 Phospho－IκBα的表達，說明17m／min的中強度運動可以減少IκBα的磷酸化。紫杉醇組NF－κBp65的表達沒有明顯下調，可能與紫杉醇在導致癌細胞發生周期阻滯的同時，也可能磷酸化Akt有關。活化的Akt可進一步激活NF－κB復合物p50／p65，使p65亞基轉位入核，從而使腫瘤細胞對紫杉醇產生耐藥性，降低療效［9］。17m／min的中強度運動聯合紫杉醇能顯著下調NF－κBp65的表達，并減少IκBα的磷酸化，說明運動干預起到了類似NF－κB抑制劑的作用，有助于紫杉醇更好地發揮療效。

4 結論

中強度運動聯合紫杉醇能抑制乳腺癌模型小鼠荷瘤的生長，延長其生存時間。減少癌細胞IκBα的磷酸化，調節NF－κB的活性，促進瘤細胞的凋亡，可能是運動聯合紫杉醇影響小鼠乳腺癌移植模型荷瘤生長的機制之一。

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