銀杏內(nèi)酯B對(duì)體外培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞延遲整流鉀電流的作用

姚陽(yáng)，劉坤，楊宇，吳敏范，張麗艷，梁宇

（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院1.生理學(xué)教研室；2.病理生理學(xué)教研室；3.2011級(jí)臨床醫(yī)學(xué)系，沈陽(yáng) 110034）

銀杏內(nèi)酯為銀杏葉提取物中的萜類化合物，分為銀杏內(nèi)酯A、B、C、M、J和白果內(nèi)酯。銀杏內(nèi)酯B是其有效成分，藥理作用廣泛，具有拮抗血小板活化因子、保護(hù)缺血損傷、抗炎、抗休克、促進(jìn)神經(jīng)可塑性和學(xué)習(xí)記憶能力等作用，對(duì)治療心腦血管疾病具有較好的療效［1］。鉀通道是人體內(nèi)分布最廣、種類最多的一種離子通道，鉀通道在細(xì)胞分子水平對(duì)于維持神經(jīng)元的靜息電位、延長(zhǎng)動(dòng)作電位的時(shí)程、改變細(xì)胞放電的頻率等有重要作用。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)鉀通道功能異常可能與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)，如阿爾茨海默病、癲癇、帕金森病等［2］。延遲整流鉀電流（delayed rectifier potassium current，IK）是電壓依賴性鉀電流的主要組成部分，是構(gòu)成動(dòng)作電位復(fù)極的主要電流，與細(xì)胞動(dòng)作電位的時(shí)程和興奮性密切相關(guān)［3］。人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH?SY5Y是一種經(jīng)常用來研究神經(jīng)保護(hù)作用的細(xì)胞系，由于其本身的特點(diǎn)常常用于建立神經(jīng)元損傷模型和神經(jīng)保護(hù)劑的篩選。本研究應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄SH?SY5Y細(xì)胞的電活動(dòng)，探討銀杏內(nèi)酯B對(duì)體外培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞IK的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

銀杏內(nèi)酯B（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)提取惠贈(zèng)）；二甲亞砜、DMEM/F12、HEPES（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司）；胰蛋白酶（美國(guó)Sigma公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus）；Axopatch200B放大器、數(shù)模轉(zhuǎn)換器（美國(guó)Axon Instrument）。

1.2 方法

1.2.1 SH?SY5Y細(xì)胞的培養(yǎng)：應(yīng)用DMEM培養(yǎng)基添加體積分?jǐn)?shù)15%的胎牛血清培養(yǎng)細(xì)胞，每2～3 d換液1次，待細(xì)胞增長(zhǎng)至80%融合時(shí)，胰酶消化細(xì)胞后，加含血清培養(yǎng)基終止反應(yīng)。用滴管吹打使其成為單細(xì)胞懸液，滴加到鋪有蓋玻片的培養(yǎng)皿中傳代［4］。

1.2.2 主要溶液配制：電極內(nèi)液（mmol/L）：K?Aspartate 50，KCl 20，HEPES 20，EGTA 1，MgCl21，CaCl20.2，NaCl 13.6，K2ATP33，KOH 調(diào)至 pH7.4。細(xì)胞外液（mmol/L）：NaCl 135，KCl 5.4，MgCl21.0，NaH2PO40.33，HEPES 10，Glucose 5.5，用 NaOH 調(diào)至 pH7.4。銀杏內(nèi)酯B灌流液（μmol/L）：將銀杏內(nèi)酯B溶解于二甲亞砜中，用細(xì)胞外液稀釋為0.1、1.0和10.0 μmol/L的灌流液。

1.2.3 膜片鉗技術(shù)記錄IK：將鋪有SH?SY5Y細(xì)胞的蓋玻片置于顯微鏡上方的浴槽內(nèi)。用兩步法拉制微電極，電極的電阻約為2～5 MΩ。在Vclamp模式下，設(shè)定保持電位為-80 mV，以10 mV為步階，使膜電位由-60 mV逐步去極化至+60 mV，持續(xù)時(shí)間300 ms，記錄外向電壓依賴性鉀電流［5］。先用細(xì)胞外液灌流細(xì)胞記錄電壓依賴性鉀電流作為對(duì)照組，再分別用濃度為0.1、1.0和10.0 μmol/L銀杏內(nèi)酯B灌流持續(xù)灌流細(xì)胞，記錄不同濃度銀杏內(nèi)酯B對(duì)電壓依賴性鉀電流的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)用pClamp10.0軟件和SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，結(jié)果以±s表示，組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＆lt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 銀杏內(nèi)酯B對(duì)IK峰值的影響

IK為最后100 ms激發(fā)出的外向鉀電流的主要成分。用pClamp10.0計(jì)算出每個(gè)細(xì)胞的電容，電流值與電容之比為電流密度（pA/pF）。以記錄時(shí)間為橫軸，記錄的電流為縱軸，繪制電流圖（圖1）。可以看出加入銀杏內(nèi)酯B后與正常對(duì)照相比，IK明顯增強(qiáng)。用0.1、1.0和10.0 μmol/L銀杏內(nèi)酯B灌流細(xì)胞，在指令電壓為+60 mV時(shí)IK峰密度值分別從（2.19±0.45）pA/pF增大至（2.48±0.37）pA/pF（P＆lt;0.05，n=5）、（2.97±0.29）pA/pF（P＆lt;0.01，n=5）、（3.15±0.48）pA/pF（P＆lt;0.01，n=5）。IK分別增大13.24%、35.62%和43.85%，具有濃度依賴性。

圖1 GB對(duì)SH?SY5Y細(xì)胞IK的影響Fig.1 Effect of GB perfusate on IKin SH?SY5Y cells

2.2 銀杏內(nèi)酯B對(duì)延遲整流鉀的電流—電壓（I?V）曲線的影響

以各命令電壓下的平均電流密度值（pA/pF）對(duì)相應(yīng)的膜電位（mV）作圖，制得I?V曲線（圖2）。結(jié)果顯示，從-60～-30 mV范圍內(nèi)各組I?V曲線基本重合，但是從-20 mV開始加入銀杏內(nèi)酯B后的IK開始升高，并且隨著進(jìn)一步的去極化升高幅度逐漸增大，電壓達(dá)到40～60 mV時(shí)增大速度明顯加快。

圖2 GB對(duì)SH?SY5Y細(xì)胞IK I?V曲線的影響Fig.2 Effect of GB perfusion on I?V curve of IK in SH?SY5Y cells

3 討論

鉀通道在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在，具有調(diào)節(jié)神經(jīng)元膜電位和興奮性的作用。在神經(jīng)元去極化后，鉀通道開放使其復(fù)極化，并有助于使膜電位穩(wěn)定在低于促發(fā)動(dòng)作電位的閾值以下，使細(xì)胞具有興奮性。本研究應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄SH?SY5Y細(xì)胞的電活動(dòng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示應(yīng)用銀杏內(nèi)酯B后SH?SY5Y細(xì)胞的IK電流明顯增強(qiáng)，并呈濃度依賴性。說明銀杏內(nèi)酯B具有開放延遲整流鉀通道的作用。

銀杏內(nèi)酯對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)多種疾病有一定的防治作用，保護(hù)腦缺血，減少再灌注損傷，抗阿爾茨海默病。研究［6］表明銀杏內(nèi)酯B（1 μmol/L）可抑制下丘腦室旁核神經(jīng)元的自發(fā)放電，也可抑制由L?谷氨酸誘發(fā)的神經(jīng)元放電。但是加入廣泛鉀通道阻斷劑四乙基胺后，這種抑制效應(yīng)被完全阻斷。說明銀杏內(nèi)酯B抑制放電的原因可能是與其開放鉀通道、增大鉀電流有關(guān)。延遲整流型鉀通道開放可能是鉀電流增大的機(jī)制。作者認(rèn)為銀杏內(nèi)酯B是通過降低神經(jīng)元活動(dòng)而發(fā)揮一定程度的保護(hù)作用。

β?淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞毒性反應(yīng)是阿爾茨海默病的重要病理機(jī)制之一。研究表明將β?淀粉樣蛋白作用于新生大鼠海馬神經(jīng)元，可明顯抑制電壓依賴性快失活鉀離子電流，而鉀電流下降直接導(dǎo)致胞內(nèi)鈣離子水平上升超出正常狀態(tài)下神經(jīng)元去極化時(shí)的水平，即可產(chǎn)生神經(jīng)毒性。這一反應(yīng)在去除β?淀粉樣蛋白后可逆轉(zhuǎn)［7］。另有研究將Aβ1?42作用于膽堿能神經(jīng)元，用全細(xì)胞膜片鉗記錄IK和瞬時(shí)外向鉀電流（IA），Aβ1?42可使IK降低（20.08±1.86）%，使IA降低（20.4±4.6）%［8］。這些研究說明銀杏內(nèi)酯B可以降低β?淀粉樣蛋白引起的神經(jīng)毒性反應(yīng)。目前認(rèn)為銀杏內(nèi)酯B具有神經(jīng)保護(hù)功能、抗阿爾茨海默病的作用，該作用可能與銀杏內(nèi)酯B增大IK電流、降低神經(jīng)元活動(dòng)有關(guān)。

［1］汪素娟，康安，狄留慶，等.銀杏葉提取物主要活性成分藥動(dòng)學(xué)研究進(jìn)展［J］.中草藥，2013，11（8）：983-985.

［2］Wang YP，Li XT，Liu SJ，et al.Melatonin ameliorated okadaic?acid induced Alzheimer?like lesions［J］.Acat Pharmacol Sin，2004，25（3）：276-280.

［3］Zhan XQ，He YL，Yao JJ，et al.The antidepressant citalopram inhib?its delayed rectifier outword K+current in mouse cortical neurons［J］.J Neurosci Res，2012，90（10）：324-336.

［4］郭鳳，姚陽(yáng)，孫威，等.無鎂誘導(dǎo)培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元與SH?SY5Y細(xì)胞自發(fā)性放電的變化［J］.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，41（7）：577-579.

［5］郭鳳，孫威，姚陽(yáng)，等.無鎂誘導(dǎo)培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元癲癇放電模型中延遲整流鉀電流的變化［J］.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，40（3）：193-195.

［6］Lin Y，Wang R，Wang X，et al.Effect of ginkgolide B on neuronal discharges in paraventricular nucleus of rat hypothalamic slices［J］.Neurosci Bull，2008，24（6）：345-350.

［7］Yu SP，F(xiàn)arhangrazi ZS，Ying HS，et al.Enhancement of outward po?tassium current may participate in beta?amyloid peptide induced cortical neuronal death［J］.Neuronal Dis，1998，5（2）：81-84.

［8］Alie K，Ma L，Yang J，et al.Aβ inhibition of ionic conductance in mouse basal forebrain neurons is dependent upon the cellular prion protein PrPC［J］.J Neurosci，2011，31（45）：16292-16297.