星形細胞腫瘤發生的分子生物學機制及與DEK mRNA表達的相關性研究

馮天達，劉云會，李超

（中國醫科大學附屬盛京醫院神經外科，沈陽 110004）

DEK原癌基因最初是在（6；9）（p23；q34）染色體異位的急性髓性白血病（acute marrow leukemia，AML）亞型中所發現［1］，該異位導致位于6號染色體短臂上的DEK編碼序列與位于9號染色體上編碼核孔復合物的CAN基因片段融合，形成5′端是DEK序列，3′端是CAN序列的融合基因DEK?CAN。作為染色質結構的調節者，DEK參與多種依賴DNA和RNA的過程，既起激活作用也起抑制作用［2，3］。本研究應用RT?PCR技術檢測星形細胞腫瘤組織及正常腦組織中DEK mRNA的表達水平，探討DEK的表達與星形細胞腫瘤發生、發展的關系，為星形細胞腫瘤的早期基因診斷及治療提供必要的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2007年6月至2009年2月中國醫科大學附屬盛京醫院神經外科手術切除并經病理證實的星形細胞腫瘤標本32例（星形細胞腫瘤組），及因顱腦外傷、腦出血行內減壓手術獲得的正常腦組織標本5例（對照組）。其中，男19例，女18例。所有病例均為初次治療，術前未接受放療、化療。去除標本的出血、壞死及電凝灼燒組織后，立即浸泡于液氮并于-70℃凍存。按WHO神經系統腫瘤分類標準（2000年）將腫瘤標本分為低級別星形細胞腫瘤組（Ⅰ級毛細胞型星形細胞瘤和Ⅱ級彌漫性星形細胞瘤，n=14）和高級別星形細胞腫瘤組（Ⅲ級間變性星形細胞瘤和Ⅳ級膠質母細胞瘤，n=18）。

1.2 方法

用Trizol總RNA提取試劑提取標本總RNA，操作嚴格按照按說明書進行。用紫外可見分光光度儀檢測RNA的純度及濃度。

反轉錄反應：反應體系6.5 μL：RNA sample（1 μg/μL）1 μL，oligo（dT）20 primer（50 mmol/L）1 μL，RNase Free dH2O 4.5 μL。反應條件：65 ℃ 5 min，冰上迅速放置至少1 min，加入cDNA Synthesis Mix 3.5 μL［5×TB 2 mL，DTT（0.1 mmol/L）0.5 mL，RNase?inhibitor（20 U/mL）0.5 mL，SuperScriptTMⅢreverse transcriptase（200 U/mL）0.5 mL］，輕混瞬時高速離心，50 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min，加入1 μL RNaseH 37℃ 20 min。

PCR：由GENBANK檢索目的基因DEK序列，應用Primer 5.0設計引物，并經NCBI在線序列相似性分析工具BLAST檢驗。DEK、內參照β?actin引物于上海生物工程有限公司合成。DEK引物序列：上游5′AAGAATGTGGGTCAGTTCAG 3′，下游5′GTGCT GCTATCTGCTTTCTT3′，反應產物494 bp，退火溫度56 ℃。β?actin引物序列：上游5′GTGGGCCGCTCTA GGCACCAA 3′；下游5′CTCTTTGATGTCACGCACG ATTTC 3′，反應產物700 bp，退火溫度58℃。PCR反應體系（10 μL）：cDNA template 1 μL，2×PCR Buf?fer 5 μ L，dNTPs mixture（2 mmol/L）1 mL，Forward primer（10 mmol/L）0.5 mL，Reverse primer 0.5 mL，Sterilized ddH2O 1.9 mL，KOD FX（2.5 U/mL）0.1 mL。按以下條件進行PCR反應：94℃2 min，94℃15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環，72 ℃ 5 min。擴增產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，待溴酚藍指示劑到達凝膠底部邊緣時停止電泳，以溴化乙錠液（1 μg/μL）覆蓋凝膠，染色5 min自動電泳凝膠成像分析系統觀察拍照。檢測吸光度值，將DEK基因目的片段條帶與β?actin電泳條帶的積分密度值（integrated density value，IDV）比值作為DEK mRNA相對含量。重復實驗3次，取平均值行統計學分析。

2 結果

在20%（1/5）正常腦組織中檢測到DEK mRNA極低水平表達，而在93.8%（30/32）的星形細胞腫瘤組織中DEK mRNA為陽性表達；DEK mRNA相對含量（DEK IDV/β?actin IDV）分別為：正常腦組織0.19±0.02，低級別星形細胞腫瘤組織（Ⅰ、Ⅱ級）0.71±0.07，高級別星形細胞腫瘤組織（Ⅲ、Ⅳ級）0.84±0.06。與正常腦組織相比，星形細胞腫瘤組織中DEK mRNA表達水平明顯增高，差異具有統計學意義（P＆lt;0.05）；與低級別星形細胞腫瘤相比，高級別星形細胞腫瘤組織中DEK mRNA表達水平明顯增高，差異具有統計學意義（P＆lt;0.05）（表1，圖1）。

表1 DEK mRNA在正常腦組織和星形細胞腫瘤組織中的表達Tab.1 Expression of DEK mRNA in brain tissues and astrocytic tumour tissues

圖1 RT?PCR法檢測DEK mRNA的表達Fig.1 Expression of DEK mRNA by RT?PCR

3 討論

人類腫瘤的發生、發展涉及多個癌基因、抑癌基因的突變導致的酶學、免疫學、生理生化改變和激素調節異常。星形細胞腫瘤的基因突變和有關調控途徑比較復雜，可能涉及TP53/MDM2/p21通路、p16/p15/CDK4/CDK6/Rb通路及PTEN基因等。隨著基因模型的建立、下游分子事件的描述等研究的深入，DEK通路的致癌機制越來越受到人們的重視。

DEK原癌基因的最初發現是以DEK?CAN融合基因的形式參與并促進AML的發生發展，并被認為是AML預后不良和再發的標志［4］。DEK既是一個原癌基因，也是自身抗原、趨化因子，參與轉錄調節、染色體結構和mRNA的形成、炎癥的發生等，但其生物學功能目前尚未闡明。研究表明，DEK原癌基因在非小細胞肺癌、乳腺癌、慢性淋巴細胞白血病的發病機制上起一定作用［5～8］，并有可能成為新的治療靶點。

本研究結果顯示：在正常腦組織中DEK mRNA表達水平極低，陽性率為20%（1/5），相對含量0.19±0.02；而在星形細胞腫瘤組織中DEK mRNA陽性表達率為93.8%，其中低級別星形細胞腫瘤組織中相對含量0.71±0.07，高級別星形細胞腫瘤組織相對含量0.84±0.06。DEK mRNA在星形細胞腫瘤組織中表達水平明顯增高，與正常腦組織相比，差異有統計學意義（P＆lt;0.05）。提示DEK的過表達與星形細胞腫瘤的發生關系密切，并對星形細胞腫瘤的早期形成起作用，主要作用于星形細胞惡變的早期。呂自力等［9］應用RT?PCR檢測32例確診為原發肝細胞肝癌組織及癌旁正常肝組織中相關基因表達情況，結果發現DEK mRNA在癌組織中陽性表達率為78.1%，癌旁正常肝組織中陽性表達率15.6%，有統計學差異（P＆lt;0.05），即使是AFP陰性的原發肝細胞肝癌也出現高表達。與本研究結果一致。因此推測DEK與腫瘤形成的初始階段有關，可在早期實施干預。DEK的檢測有可能成為星形細胞腫瘤早期基因診斷的指標。

本研究結果還顯示：DEK的表達水平與星形細胞病理級別密切相關，DEK mRNA在高級別星形細胞腫瘤組織中表達水平明顯增高，與低級別星形細胞腫瘤相比，有統計學差異（P＆lt;0.05）。既往的研究結果顯示：DEK mRNA表達與肝細胞肝癌的組織學分級相關，在去分化的肝細胞肝癌中，DEK mRNA處于高水平狀態［9］；DEK的表達程度越高，肝細胞肝癌的惡性化潛能越高。結合本研究結果，可以認為：DEK過表達不但與星形細胞腫瘤的發生關系密切，而且與腫瘤的發展也密切相關。DEK過表達可能是腫瘤由低惡性度向高惡性度演化的重要原因，同時也在一定意義上反映了星形細胞腫瘤的惡性潛能。

［1］Garcon L，Libura M，Delabesse E，et al.DEK?CAN molecular moni?toring of myeloid malignancies could aid therapeutic stratification［J］.Leukemia，2005，19（8）：1338-1344.

［2］Kappes F，Damoc C，Knippers R，et al.Phosphorylation by protein kinase CK2 changes the DNA binding properties of the human chro?matin protein DEK［J］.Mol Cell Biol，2004，24（6）：6011-6020.

［3］Kappes F，Burger K，Baack M，et al.Subcellular localization of the human proto?oncogene protein DEK［J］.J Bio Chem，2001，276（28）：26317-26323.

［4］Deguchi K，Gilliland DG.Cooperativity between mutations in tyro?sine kinases and in hematopoietic transcription factors in AML［J］.Leukemia，2002，16（4）：740-744.

［5］Alexiadis V，Waldmann T，Andersen J，et al.The protein encoded by the proto?oncogene DEK changes the topology of chromatin and reduces the efficiency of DNA replication in a chromatin?specific manner［J］.Genes Dev，2000，14（11）：1308-1312.

［6］Wang J，Sun L，Yang M，et al.DEK Depletion negatively tegulates Rho/ROCK/MLC pathway in non?small cell lung cancer［J］.J Histo?chem Cytochem，2013，61（7）：510-521.

［7］Privette Vinnedge LM，Ho SM，Wikenheiser?Brokamp KA，et al.The DEK oncogene is a target of steroid hormone receptor signaling in breast cancer［J］.PLoS One，2012，7（10）：e46985.doi：10.1371/journal.pone.0046985.Epub 2012 Oct 10.

［8］Wang DM，Liu L，Fan L，et al.Expression level of DEK in chronic lymphocytic leukemia is regulated by fludarabine and Nutlin?3 de?pending on p53 status［J］.Cancer Biol Ther，2012，13 （14）：1522-1528.

［9］呂自力，文劍明，羅殿中，等.腫瘤相關基因在肝細胞癌及癌旁正常肝組織中表達［J］.臨床與實驗病理學雜志，2004，20（6）：654-657.