急性子總皂苷的提取工藝

朱 娜,孟 磊,張培旭,姚 華,金永日,李緒文

(1. 吉林大學 化學學院,長春 130012；2. 吉林省環境監測中心站,長春 130011；3. 聚光科技股份有限公司,杭州 310052)

急性子為鳳仙花科鳳仙花屬植物鳳仙花(ImpatiensbalsaminaL.)的干燥成熟種子,在夏、 秋季果實成熟而未開裂時采收,曬干,搓出種子[1]. 急性子微苦、 性溫、 有小毒[2],有破血軟堅和消積的功效. 主治經閉、 噎膈、 腹部腫塊、 骨哽咽喉和外瘍堅塊,在臨床可用于避孕、 終止早孕、 治療食管賁門癌癥和骨質增生等[3]. 急性子中含有皂苷、 黃酮、 揮發油、 萘醌及糖類等成分,其中具有較好抗腫瘤活性的皂苷類化合物含量最高[4-7]. 為得到更多的總皂苷有效組分,本文考察急性子中4種主要皂苷類化合物鳳仙萜四醇苷A,B,C和K,通過優化影響總皂苷提取率的幾種因素,建立了急性子總皂苷的最優提取條件,為急性子總皂苷藥理作用研究提供了理論依據.

1 儀器與樣品

Aglient1200型高效液相色譜儀;Aglient Eclipse XDB-C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)色譜柱;Alltech2000型蒸發光散射檢測器;Startorius YDO-OIR型電子天平;TYS-200型粉碎機(浙江永康紅太陽機電有限公司);RE-201C型旋轉蒸發儀(鞏義市英峪予華儀器廠);SHZ-CB型循環水式多用真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠);KQ-250B型超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司). 色譜純甲醇(美國Fisher公司);自制二次蒸餾水;回流用試劑均為分析純(北京化工廠).

急性子藥材購自安徽省亳州市,經長春中醫藥大學鄧明魯教授鑒定為中藥急性子,實驗前將急性子藥材粉碎過100目篩,混勻得急性子粉末. 對照品鳳仙萜四醇苷K(化合物H1)、 鳳仙萜四醇苷A(化合物H2)、 鳳仙萜四醇苷B(化合物H3)和鳳仙萜四醇苷C(化合物H4)均為自制,其質量分數分別為98.4%,99.3%,98.0%,99.7%.

2 測定方法

2.1 液相條件 由于急性子皂苷類化合物在紫外波長范圍內無吸收,因此選擇蒸發光散射檢測器進行檢測. 高效液相色譜檢測條件為：流動相：0～20 min,V(甲醇)∶V(水)=46∶54;20～60 min,V(甲醇)∶V(水)=6∶4;柱溫：t=25 ℃;流速：v=1.0 mL/min;進樣量：20 μL. 蒸發光散射(ELSD)檢測條件為: 漂移管溫度t=91 ℃,載氣流速為2.5 L/min ,放大系數為1.0,撞擊器模式關.

2.2 對照品質量分數測定方法 分別稱取對照品H1～H4各25.0 mg,以V(甲醇)∶V(水)=46∶54溶解并定容至25.0 mL容量瓶中,搖勻,制得混合對照品溶液. 分別精密量取該標準溶液1.0,2.0,3.0,4.0,6.0,10.0 mL于10 mL容量瓶中,用V(甲醇)∶V(水)=46∶54定容至刻度,搖勻,配成0.10,0.20,0.30,0.40,0.60,1.00 mg/mL的標準溶液. 分別取上述對照品溶液各20 μL,注入高效液相色譜儀,以樣品峰面積的常用對數對進樣質量的常用對數進行線性回歸分析. 結果表明,當進樣質量為2.0～20.0 μg時,化合物H1～H4峰面積的常用對數值與進樣質量的常用對數值均呈較好的線性關系. 對照品回歸方程分別為：

化合物H1：lgY=1.648 4lgX+4.464 1,r=0.999 5;

化合物H2：lgY=1.566 4lgX+4.600 2,r=0.999 2;

化合物H3：lgY=1.476 9lgX+4.719 0,r=0.999 7;

化合物H4：lgY=1.593 8lgX+4.617 8,r=0.999 7.

2.3 急性子中化合物H1～H4質量比的測定 稱取3份2.0 g急性子粉末,分別置于100 mL圓底燒瓶中,用12 mL體積分數為70%的乙醇回流提取5次,時間均為60 min. 將提取液過濾,合并,減壓濃縮,以V(甲醇)∶V(水)=46∶54定容至10 mL容量瓶中. 按2.1中色譜方法及條件,測定提取物中化合物H1～H4的質量比,結果列于表1.

表1 急性子中H1～H4的質量比Table 1 Mass contents of H1—H4 in the seeds of Impatiens balsamina L.

3 實驗方法及結果

3.1 提取溶劑的單因素考察 由于急性子皂苷類成分為極性較大的化合物,且化合物熱穩定性好,因此選擇極性較大的溶劑進行回流提取[8-9]. 本文選擇水、 甲醇和乙醇作為溶劑進行單因素考察. 稱取等質量急性子粉末,分別用V(液)∶m(料)=8的水、 甲醇和乙醇回流提取3次,將提取液過濾,合并,定容,按2.1中色譜方法和條件用HPLC-ELSD測定提取物中化合物H1～H4的質量比,以每克藥材中提取得到的化合物H1～H4的質量以及它們的總質量(mg/g)衡量提取效果. 實驗結果表明: 水的提取效果較差;甲醇和乙醇對H1～H4的提取效果較好,但甲醇毒性較大,因此選擇乙醇作為回流提取溶劑.

3.2 不同體積分數乙醇對提取率的影響 稱取急性子粉末2.0 g,共7份,分別用16 mL體積分數為90%,80%,70%,60%,50%,30%,20%的乙醇回流提取3次,回流時間分別為60,45,30 min. 過濾,合并提取液,減壓濃縮,用V(甲醇)∶V(水)=46∶54定容至10 mL容量瓶中. 過0.22 μm微孔濾膜,取續濾液按2.1中色譜條件及方法測定提取物中H1～H4的質量比,以每克藥材提取得到的化合物H1～H4的質量以及它們的總質量衡量提取效果,結果列于表2.

表2 不同體積分數的乙醇對化合物H1～H4提取率的影響Table 2 Effect of extraction rate of compound H1—H4 with different volume fraction of ethanol

由表2可見,當φ(乙醇)=60%,70%,80%時,溶劑對化合物H1～H4的提取率相對較高且提取率相差較小,因此選擇這3個體積分數的乙醇溶液作為提取溶劑進一步優化提取條件.

3.3 提取條件優化 在上述實驗數據基礎上,為確定回流提取的最優條件,本文通過正交試驗(L933),考察乙醇的體積分數、V(液)∶m(料)和回流次數3個因素對急性子中化合物H1～H4提取率的影響. 試驗因素與水平列于表3. 稱取急性子粉末2.0 g,共9份. 按表3中列出的各項正交試驗條件進行水浴回流提取,按2.1中色譜方法和條件,測定不同提取條件下提取物中化合物H1～H4的質量(mg)并計算提取率(提取率=(實測值/總質量)×100%),進一步篩選最佳提取條件. 實驗結果列于表4和表5.

表3 (L933)正交試驗因素水平Table 3 (L933)Levels of orthogonal test factors

表4 (L933)正交試驗結果Table 4 (L933) Results of orthogonal test

由表5可見,本文考察的3種因素對總皂苷的提取率均影響較小,因此可采用直觀分析法選擇最佳提取工藝. A因素中KA2>KA1>KA3,故選擇A2；B因素中KB1>KB2>KB3,故選擇B1；C因素中KC3>KC2>KC1,故選擇C3. 因此最佳提取工藝為A2B1C3,即：φ(乙醇)=70%,V(液)∶m(料)=6,回流提取4次,回流時間分別為60,45,30,30 min.

表5 正交試驗結果方差分析*Table 5 Analysis of variance about the results

* F0.01(2,2)=99,F0.05(2,2)=19,F0.1(2,2)=9.

3.4 急性子總皂苷提取工藝的驗證 稱取急性子粉末100.0g,共3份,分別置于1 000mL圓底燒瓶中,按3.3中篩選的最優化提取條件回流提取,將提取液過濾,合并,減壓濃縮,以V(甲醇)∶V(水)=46∶54定容至100mL容量瓶中,從中移取2mL,用V(甲醇)∶V(水)=46∶54稀釋并定容至10mL容量瓶中. 按2.1中色譜方法及條件,測定提取物中化合物H1～H4的質量比,并計算各化合物的提取率,結果列于表6.

表6 驗證試驗結果Table 6 Results of verified test

綜上,本文通過正交試驗優化得到的條件對總皂苷的提取率為98.19%,明顯高于正交試驗結果,最終確定急性子總皂苷最優提取條件為：φ(乙醇)=70%,V(液)∶m(料)=6,回流提取4次,提取時間分別為60,45,30,30 min.

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