葉酸抑制同型半胱氨酸誘導的人腎臟系膜細胞增殖

曹露，婁曉盈，牟娜娜，張泉，譚紅梅

（中山大學中山醫學院病理生理教研室，廣州 510080）

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是蛋氨酸轉甲基過程中的一個產物，高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinemia，HHcy）是心血管疾病的獨立危險因素［1］。臨床上，血漿Hcy正常濃度為5～15μmol／L，HHcy被定義為血漿 Hcy濃度在15 μmol／L以上［2］。體內外的研究［3－5］表明 Hcy與腎小球的損傷有一個緊密的聯系。葉酸（folic acid，FA）是人體必需的維生素，在Hcy與蛋氨酸之間的相互轉化過程中充當一碳單位的載體，在Hcy再次甲基化到蛋氨酸的過程中發揮重要的作用。大量研究觀察發現Hcy水平和FA水平呈現一個相反的關系，更進一步的研究實驗［6－8］顯示FA能夠降低血透病人、慢性腎移植、晚期腎病患者血漿Hcy濃度。在眾多促進腎小球病變的因子中，轉化生長因子－β（transforming growth factor－β，TGF－β）可以調節細胞的增殖、分化和凋亡，與腎臟纖維化和硬化的發生密切相關，但是對TGF－β在Hcy介導的腎小球損傷中的作用研究還不夠充分，FA能否降低Hcy導致的腎小球損傷以及TGF－β是否參與了這一過程還沒有得出確定的結論。眾所周知，腎小球系膜細胞是腎小球中非常活躍的細胞，具有收縮、支持、吞噬和分泌腎素的作用，對腎小球發揮正常功能具有重要意義。本實驗采用體外培養人腎臟系膜細胞（human renal mesangial cells，HMCs）來進行研究，觀察Hcy對HMCs增殖的影響和葉酸的干預作用，以及TGF－β、ERK是否參與了這一過程。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI1640（Roswell Park Memorial Institute 1640）培養基購于美國GIBCO公司，鼠抗人TGF－β單克隆抗體、鼠抗人ERK單克隆抗體及鼠抗人β－肌動蛋白（β－actin）單克隆抗體，購于美國Santa Cruz Biotechnology公司；辣根過氧化物酶標記抗小鼠抗體（evision two－stepTManti－mouse detection reagent，HRP）購自 Antibody Diagnostica Inc公司；噻 唑 藍 （methylthiazolyldiphenyl－tetrazolium bromide，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購于Sigma－Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT法測定細胞活力 收集對數期生長的HMCs，調整細胞密度，以1×104／孔接種于96孔板，置于37℃，5%CO2培養箱培養使細胞貼壁，細胞匯合度達50%～60%以上時，加入不同濃度的Hcy（0、200、400、600、800、1 000μmol／L）或 Hcy（400μmol／L）加不同濃度的 FA（50、100、200 μmol／L）處理24h，PBS輕輕洗滌，加入180μL新鮮培養液，再加入20μL MTT溶液，繼續培養4h，終止培養，每孔加入150μL DMSO，在酶聯免疫檢測儀492nm處測量各孔的吸光值。

1.2.2 Western blot法檢測 TGF－β和 ERK 的表達 以2×105／mL的密度接種HMCs，待細胞貼壁后，以不同的Hcy濃度、Hcy加不同濃度的FA處理細胞，48h后收集細胞，RIPA裂解液裂解，超聲破碎，Bio－RAD蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度，在聚丙酰胺凝膠中電泳后，250mA恒流濕轉蛋白于硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1h，ERK一抗（1∶1 000），TGF－β一抗（1∶1 000）孵育過夜后，TBST洗3次，二抗孵育1h，TBST洗3次，膜鋪于曝光盒中，將適量的發光液滴在膜上，于暗室中曝光、顯影。

1.2.3 統計學分析 采用SPSS 13.0統計學軟件對HMCs存活率進行方差分析，采用TEST分析法對不同濃度的Hcy處理后和Hcy與不同濃度FA共同處理后各組間差異進行分析。

2 結果

2.1 Hcy誘導HMCs細胞增殖

MTT結果顯示，與對照組相比，Hcy處理后劑量依賴性地促進細胞增殖（見圖1）。Hcy 400 μmol／L時增殖明顯（P＜0.01），選取400μmol／L濃度的Hcy進行葉酸干預作用的研究。

圖1 Hcy誘導HMCs細胞增殖不同濃度Hcy處理HMCs 24h，采用MTT法測定各組細胞活力。與對照組（Hcy＝0）比較，＊P＜0.05，＃P＜0.001

2.2 FA抑制Hcy誘導的HMCs細胞增殖

加入不同劑量FA干預后，與Hcy 400μmol／L組對比，HMCs細胞增殖能力呈現劑量依賴性地下降（見圖2）。

2.3 Hcy增強TGF－β和ERK蛋白表達

Western blot結果顯示，對照組TGF－β和ERK微量表達；Hcy處理后，隨著劑量的升高，TGF－β和ERK的表達依次增強（見圖3）。

2.4 FA抑制Hcy誘導的TGF－β和ERK蛋白表達

使用FA干預后，與400μmol／L濃度的 Hcy組比較，TGF－β和ERK的表達下降，并呈劑量依賴趨勢（見圖4）。

3 討論

McCully于1969年最先將重度HHcy（100～450μmol／L）與動脈粥樣硬化疾病相聯系，重度HHcy是由于參與Hcy代謝的轉甲基或轉硫作用的酶缺陷所致，常見的有胱硫酶合成酶及亞甲基四氫葉酸還原酶缺陷，重度HHcy病人有早發性動脈粥樣硬化，動靜脈栓塞及智力障礙。Ingram等［5］用體外培養的Sprague－Dawley大鼠的系膜細胞，首次研究證實Hcy在腎小球病變中發揮的作用和在血管病變中發揮的作用是一致的，提出Hcy在慢性腎臟病變的進展中發揮著潛在性作用，ERK的激活參與了Hcy導致的腎損傷的過程。進一步的實驗證實增加的Hcy水平也能直接作用腎小球的細胞，引起腎小球的損傷和最終的硬化。本實驗采用體外培養的HMCs，遺傳缺陷性劑量的Hcy，測定細胞活力、ERK和TGF－β的蛋白表達量。MTT檢測顯示Hcy明顯刺激了HMCs的增殖并且有劑量依賴的關系，同時觀察到Hcy處理的HMCs，ERK的蛋白表達量升高。有文獻［9］報道ERK通路的阻礙引起HMCs增殖的明顯降低。進一步的報道［10］表明ERK通路的激活在腎小球損傷的過程中的作用與細胞的增殖相關。無論是動物模型還是人類疾病，TGF－β被認為是一個多器官病理變化的發病機制，在同型半胱氨酸血癥的模型中，增加的TGF－β的蛋白表達量升高不僅發生在心臟，還發生在肺和肝臟，許多研究證實TGF－β作為腎小球硬化關鍵性的調節因子，其水平升高與腎小球的病變過程相聯系，也有研究［11］提出TGF－β和ERK的潛在性聯系，誘導系膜細胞增殖的發生，但是TGF－β與Hcy導致的腎臟損傷之間的關系還沒有完全被證實。我們的實驗觀察到在Hcy處理后TGF－β的表達與對照組相比有明顯的變化。FA的保護作用在心血管方面的研究最為廣泛，在腎臟損傷的保護中也具有重要的臨床意義，但是FA對Hcy導致的腎臟損傷的保護機制還沒有得到證實，TGF－β是否參與FA對Hcy導致的腎損傷保護的報道更少。本實驗采用體外的細胞模型，在400μmol／L Hcy損傷的基礎上用不同濃度的FA進行干預，觀察到FA能抑制Hcy誘導的HMCs細胞增殖，TGF－β蛋白表達也相應下降。通過實驗得出TGF－β和ERK可能參與了FA抑制Hcy誘導的HMCs細胞增殖作用。

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