二乙基亞硝胺誘導小鼠肝癌的時鐘基因表達變化

金濤，文國容，金海，陸遠富，劉杰，3＊

（1.遵義醫(yī)學院藥理學教研室及貴州省基礎藥理重點實驗室，遵義 563000；2.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科；3.University of Kansas Medical Center，Kansas City，KS 66160，USA）

原發(fā)性肝癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年新發(fā)肝癌患者約60萬，居惡性腫瘤第5位。目前我國的發(fā)病人數(shù)約占全球的半數(shù)以上，已成為嚴重影響我國人民健康和生命的一大殺手。近年來有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與時辰節(jié)律也存在一定的關聯(lián)性。哺乳動物的多種生理、生化行為都表現(xiàn)出一定的節(jié)律變化，并受到時鐘基因的調(diào)控。時鐘基因不僅參與正常組織基因的表達而且也通過對致癌基因、抑癌基因和內(nèi)分泌通路的影響，多方面參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展［1］。國內(nèi)外常用二乙基亞硝胺（diethylnitrosamine，DEN）來誘導建立肝癌動物模型［2］，以達到模擬人體肝癌病變過程。本文亦通過DEN誘導建立肝癌模型來檢測正常組織、癌組織、癌旁組織中時鐘基因的表達，進一步探討時鐘基因在DEN誘導肝癌情況下的變化。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

二乙基亞硝胺（diethylnitrosamine，DEN）購自天津化學試劑研究所；Trizol購自TakaRa公司；High Capacity Reverse Transcriptase Kit購自Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA；Power SYBR Green PCR Master Mix購自Takara公司；美國 BIO－RAD 熒光定量 PCR 儀，儀器編號：20050034；德國Eppendorf多功能梯度PCR儀，儀器編號：20050017；北京普析通用儀器有限責任公司TU－1810 紫 外－可見分光光度計，儀器編號：20040425。

1.2 方法

1.2.1 動物及分組 18只健康C57BL／6J小鼠，雄性，體質(zhì)量18～22g，購自重慶第三軍醫(yī)大大坪醫(yī)院實驗動物中心。動物許可證號：SCXK（渝）2012－0001。飼養(yǎng)于光照－黑暗12h交替（光照期6：00～18：00）的SPF程控環(huán)境，自由飲水進食，動物房室溫維持在23℃左右。適應性喂養(yǎng)1w后全部小鼠隨機分為正常組6只，肝癌組12只。

1.2.2 造模及取材 參考有關文獻［3］，取肝癌組小鼠先一次腹腔注射DEN 100mg／kg，3d后以CCl4和橄欖油（20∶80）灌胃，0.05mL／10g，2次／w；第3周再腹腔注射DEN 1次（50mg／kg），同時開始給予含有9%乙醇的飲用水，第4周加大CCl4劑量至0.08mL／10g，正常組僅自由飲用滅菌普通水，觀察兩組小鼠活動情況，連續(xù)16w后于10：00處死動物。取正常組（正常組織）、肝癌組（癌旁組織和癌組織）組織備用。

1.2.3 Real－Time RT－PCR 檢測基因的表達 取50～100mg的正常肝組織、癌旁組織、癌組織分別置于1mL Trizol中勻漿，加入200μL的氯仿，震蕩混勻，12 000r／min，4℃離心10min。吸取上清300μL轉(zhuǎn)入另外去酶EP管中，加等量異丙醇混勻后，12 000r／min，4℃離心10min，棄去上清，使用75%乙醇（DEPC水配置）在7 500r／min，4℃離心5min情況下洗滌2次，室溫干燥后加入100μL DEPC水。利用TU－1810紫外－可見分光光度計測其260／280比值，檢測其純度和濃度。采用 High Capacity Reverse Transcriptase Kit逆轉(zhuǎn)錄純化的RNA，所得cDNA利用特異引物（見表1）進行實時定量PCR擴增，反應條件參照試劑盒說明書進行。利用G3PDH對各基因的表達進行歸一化處理。

表1 實時熒光定量PCR底物序列

圖1 肝臟巨檢及實時熒光定量PCR檢測正常組織、癌旁、癌組織中AFP表達。±s，n＝12，與正常組比較，＊P＜0.05

圖2 實時熒光定量PCR檢測正常組織、癌旁、癌組織中Bmal1、Dbp和Rev－ErbαmRNA表達?！纒，n＝12，與正常組比較，＊P＜0.05

1.2.4 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)應用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析（one－way ANOVA），組間比較用LSD檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肝臟組織巨檢及腫瘤標志基因AFP mRNA的表達

肝癌組在16w后巨檢發(fā)現(xiàn)肝表面凹凸不平，散在直徑大小不等的結節(jié)（見圖1）。甲胎蛋白（Alpha Fetoprotein，AFP）是原發(fā)性肝癌的高特異性和高靈敏度的腫瘤標志物。經(jīng)實時熒光定量PCR結果顯示，AFP mRNA在癌組織中高表達，約為正常組織表達量10倍（P＜0.05）（見圖1），提示肝癌組小鼠已被成功誘發(fā)肝癌。

2.2 時鐘基因mRNA的表達

本實驗組已成功檢測出時鐘基因Brain muscle ARNT－like protein 1（Bmal1）、albumin site D－binding protein（Dbp）和 Nuclear receptor Rev－erb alpha（Rev－erb）在正常雄性昆明小鼠中 mRNA表達的節(jié)律性變化（見圖2）。本實驗10：00取材的正常肝組織中Bmal1表達較高，Dbp和Rev－Erbα表達較低；而同正常組相比較，Bmal1在癌旁組織、癌組織中的表達明顯下調(diào)（P＜0.05），下降到正常組的1／3；Dbp和 Rev－Erbα在癌旁組織、癌組織中mRNA的表達顯著上升（P＜0.05），達到正常組的2～4倍（見圖2）；癌旁組織與癌組織差異無統(tǒng)計學意義。

3 討論

本實驗結果顯示，小鼠正常肝臟組織的時鐘基因表現(xiàn)出一定的節(jié)律變化，Bmal1基因的表達量在10：00較高，Dbp和 Rev－Erbα在10：00僅有少量表達。這與本實驗組近期的研究結果［4，7］相一致。經(jīng)DEN誘導C57BL／6J小鼠肝癌形成的條件下，其癌旁組織和癌組織的時鐘基因的節(jié)律已顯示出紊亂。Bmal1基因表達量顯著下調(diào)，Dbp和Rev－Erbα的表達量明顯上升。

節(jié)律性的生命活動廣泛存在于各種生物體中，從單細胞生物到植物、動物直至人類，都受到時鐘基因的調(diào)控。目前已知有很多的時鐘基因參與了生物體節(jié)律活動的調(diào)節(jié)，如：Bmal1、Dbp和 Rev－Erbα等。Bmal1在哺乳動物生物鐘的轉(zhuǎn)錄、翻譯反饋環(huán)中以異源二聚體的形式激活Dbp、Rev－Erbα發(fā)揮重要作用。Dbp、Rev－Erbα表達蛋白入核又反過來抑制Bmal1的轉(zhuǎn)錄，由于基因轉(zhuǎn)錄和蛋白入核需要一定時間，這樣就使被調(diào)控的基因呈現(xiàn)出生物節(jié)律［5］。亦有研究［6］表明Rev－Erbα對維持晝夜節(jié)律的長度和相位是必須的，并與Dbp及其它因子共同組成鐘控基因小組，用以控制其下游的時鐘基因。而生物的節(jié)律活動并不是僅依靠時鐘基因來實現(xiàn)的，本實驗組發(fā)現(xiàn)藥物代謝關鍵酶細胞色素P450、金屬硫蛋白和抗氧化基因同樣存在晝夜節(jié)律［4，7］，提示了生物節(jié)律的重要性。

時鐘基因與其它基因共同作用參與機體的多種生理功能和疾病的病理過程，如：血壓和心肌缺血顯示出節(jié)律性［8］，下丘腦肽類物質(zhì)胃腸肽、促胃液素等也顯示出晝夜周期節(jié)律變化［9］，這都與時鐘基因的正常調(diào)控存在密切聯(lián)系。更為重要的是時鐘基因能夠影響細胞的增殖周期和凋亡、神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫功能，這些都與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關系密切。因而時鐘基因的紊亂有可能促使腫瘤發(fā)生，加速腫瘤的發(fā)展［10］。大量研究表明時鐘基因的紊亂可增高乳腺癌發(fā)病率和結腸癌的發(fā)生機會，同時與造血系統(tǒng)腫瘤的產(chǎn)生也存在著一定的相關性。亦有研究顯示在乳腺癌患者中發(fā)現(xiàn)褪黑素的周期性改變，在卵巢癌、胃癌中激素分泌存在晝夜節(jié)律的改變。本實驗結果清楚顯示在小鼠肝癌組織中時鐘基因表達發(fā)生了紊亂。究竟是肝癌的發(fā)生改變了時鐘基因的節(jié)律性，還是時鐘基因的紊亂促進了肝癌的發(fā)生，或二者均存在，這需要進一步的研究去證實。

DEN在整個誘癌過程中經(jīng)歷肝細胞損傷再生到硬化直至癌變的過程，與人類肝癌發(fā)生的經(jīng)歷階段類似［11］，從而彌補了臨床標本的不足，為研究肝癌的發(fā)生、發(fā)展提供基礎。本實驗在采用DEN誘導小鼠肝癌形成的條件下，檢測出時鐘基因在癌組織和癌旁組織顯示出紊亂，為時鐘基因與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關聯(lián)性的研究提供了一定的實驗依據(jù)。

［1］王雅平，華魯純，張延齡，等.生物鐘基因與腫瘤［J］.國際外科學雜志，2006，33（4）：279－283.

［2］李笑巖，白咸勇，劉同慎，等.二乙基亞硝胺誘發(fā)大鼠肝癌模型的建立及病理學改變［J］.濱州醫(yī)學院學報，2007，30（6）：401－403，406.

［3］匡志鵬，謝裕安，楊帆，等.C57BL／6J小鼠肝癌動物模型的建立［J］.中國普通外科雜志，2007，16（7）：657－660.

［4］Xu YQ，Zhang D，Jin T，et al.Diurnal Variation of Hepatic Antioxidant Gene Expression in Mice［J］.PLoS One，2012，7（8）：e44237.

［5］倪銀華，吳濤，王露，等.腎上腺糖皮質(zhì)激素與生物鐘基因表達調(diào)控的相關研究進展［J］.遺傳，2008，30（2）：135－141.

［6］徐祖元.哺乳動物晝夜節(jié)律生物鐘的研究進展［J］.生命科學，2004，16（2）：104－108.

［7］Zhang D，Jin T，Xu YQ，et al.Diurnal－and sex－related difference of metallothionein expression in mice ［J］.J Circadian Rhythms，2012，10（1）：1－8.

［8］徐晨，錢睿哲，金惠銘.生物鐘基因與心血管疾?。跩］.中國病理生理雜志，2006，22（7）：1450－1453.

［9］田愛花.生物鐘基因與胃腸道的關系［J］.醫(yī)學新知雜志，2012，22（3）：193－195.

［10］樂凡，葉勝龍.晝夜節(jié)律鐘基因與腫瘤［J］.中國腫瘤生物治療雜志，2007，14（1）：83－86.

［11］朱艷志，孔憲炳，顏朗，等.間斷給藥DEN誘導大鼠肝癌模型建立及病理研究［J］.重慶醫(yī)科大學學報，2010，35（12）：1843－1846.