酶法制備白鰱魚蛋白粉的研究

王 麗，姜啟興，許艷順，夏文水

(江南大學食品學院，江蘇無錫214122)

淡水魚的加工可開發魚糜制品、魚腸、魚圓和魚干以及魚罐頭等產品，這些產品已有工業化生產并在市場銷售。另一類主要產品是魚蛋白粉。魚蛋白粉是用魚肉通過消化、過濾、濃縮、噴霧干燥而得到的一種淺黃色至類白色的粉末，具有含水量低、利于貯藏的特點，可進行大規模工業化生產。目前，魚蛋白粉的生產主要還是集中在飼用魚粉方面，產品質量不高。已有學者在開發食用魚蛋白粉，采用的技術主要是酶解技術［1－2］。Ting［1］等以龍頭魚為原料，通過酶解、冷凍干燥等工藝，開發出一種魚蛋白粉產品。Ting［2］等制備了凍干帶魚蛋白粉并對其營養進行評價，表明帶魚蛋白粉蛋白質含量豐富，必需氨基酸含量高，具有很高的營養價值，可以作為蛋白質強化劑應用于食品工業中。但魚蛋白粉產品還存在溶解性不好、分散性差等問題，需要進一步研究溶解性好、分散性好的魚蛋白粉，以擴大魚蛋白粉的應用范圍。魚蛋白溶液的干制通常有真空干燥法，但生產效率不高。噴霧干燥法是一種自動化程度高可連續大規模生產的干燥方法，生產的蛋白粉受熱時間短、復水性好，質量高。魚蛋白溶液濃度的高低和噴霧干燥條件對于干燥節能和蛋白粉質量有密切的關系。本文旨在通過研究木瓜蛋白酶水解條件對魚蛋白水解度的影響以及噴霧干燥條件對蛋白粉物性和水溶性的影響，確定木瓜蛋白酶水解白鰱魚蛋白的最適條件以及噴霧干燥的合理條件，最后對制得的魚蛋白粉的營養品質進行分析，為食用魚蛋白粉的開發應用提供指導與參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活白鰱魚(2～3kg) 購于無錫市濱湖區雪浪鎮農貿市場;木瓜蛋白酶(酶活80萬U/g) 廣西南寧龐博生物科技有限公司;氫氧化鈉、鹽酸等其他試劑:分析純 國藥集團化學試劑有限公司。

DK－8AXX型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司;AB104－N型電子天平 上海第二天平儀器廠;EL3002型電子天平、pH計 梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司;XBLL－25型多功能食品加工機 上海帥佳電子科技有限公司;TDL－5－A型離心機 上海安亭鎮飛鴿牌離心機;XMTFCH－6000型消化爐 上海儀器檢測有限公司;Qz－4型噴霧干燥設備 錫山林州干燥廠;Waters 600型高效液相色譜儀 美國waters公司;Agilent 1100型高效液相色譜儀 美國Agilent Techologies。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚處理 將購得的鮮活白鰱魚，經宰殺、去鱗、去內臟、去頭、去尾、剝皮，清洗干凈后采肉，經初步破碎再用絞肉機絞碎成均勻糜狀。

1.2.2 魚肉酶水解 稱取500g魚糜置于酶解罐中，加入一定量的蒸餾水，設定溫度，調整pH，加入一定量的木瓜蛋白酶，水解一定時間;100℃滅酶15min，冷卻至室溫。

1.2.3 水解條件的確定 酶解過程中的酶解溫度、pH、加酶量、酶解時間和底物濃度都會影響酶解的效率，主要以水解度為指標對酶解條件進行優化。

1.2.4 水解度測定 水解度(Degree of Hydrolysis，DH)測定參照 Aider－Nissen 等［3］，在中性及酸性條件下采用pH－stat法。水解度的計算公式:

式中:Vb:消耗的氫氧化鈉溶液的體積，mL;Nb:氫氧化鈉溶液的摩爾濃度，mol/L;α:氨基解離度(根據具體情況而定);Mp:底物中蛋白質的質量，g;Htot:底物蛋白質中的肽鍵總數，mmol/g，對于魚肉，Htot=8.4mmol/g。

1.2.5 黏度的測定 使用Brookfield DV－Ⅱ+Pro型黏度儀在25、60℃恒溫水浴條件下測定酶解液的體系黏度，使用SC4－18轉子測量。

1.2.6 蛋白粉溶解度的測定 溶解度測定法［4］。

1.2.7 干燥條件的確定 根據盡可能降低能耗的原則，在不同的蛋白質水解液固形物含量與干燥進風溫度和進料速度下得到魚蛋白粉，測定該魚蛋白粉的水分含量、白度、堆積密度、分散性和流動性等理化指標，從而確定魚蛋白粉噴霧干燥的合適條件。

1.2.8 基本成分測定 水分含量:105℃恒重法［5］;粗蛋白質含量:凱氏定氮法［6］。

1.2.9 堆積密度的測定 將魚蛋白粉從漏斗中撒落至10mL量筒中，測定10mL魚蛋白粉的質量，換算出其堆積密度(g/mL)。

1.2.10 白度的測定 采用UltraScan Pro高精度分光測色儀測定粉末樣品的L*、a*、b*值。按照下式計算產品的白度W:

W=100－［(100－L*)2+a*2+b*2］0.5

式中:L*值表示樣品的亮度，值越大表示樣品亮度越高;a*值表示樣品的紅綠值，+a*表示樣品偏紅，－a*表示樣品偏綠;b*值表示樣品的藍黃值，+b*表示樣品偏黃，－b*表示樣品偏藍。

1.2.11 潤濕性的測定 在250mL燒杯中加入200mL去離子水，稱取0.5g樣品均勻撒布于水面上，在靜置條件下，測定魚蛋白粉從加入到潤濕所需要的時間(s)。

1.2.12 分散性的測定 在100mL燒杯中加入50mL去離子水，加入5g魚蛋白粉，在恒溫磁力攪拌器上以一定的轉速攪拌，記錄從攪拌開始至粉全部分散所需的時間(s)，分散時間越少，分散性越好。

1.2.13 流動性的測定 將漏斗固定于水平放置的坐標紙上高度H處，將魚蛋白粉沿漏斗壁倒入下方坐標紙上形成的粉圓錐體尖端接觸到漏斗口為止，測定坐標紙上圓錐體底部的半徑(R)，計算休止角α=arctg(H/R)，式中:H:漏斗口與坐標紙的垂直距離(mm);R:粉圓錐體底部的半徑(mm);α:休止角，粉圓錐體沿底面直徑縱切后所得三角形的底角(°)。休止角越小表明流動性越好。

1.2.14 均質魚蛋白粉的制備 稱取500g魚糜，加入1000mL的蒸餾水，均質3遍后進行噴霧干燥，噴霧干燥條件同酶法制備魚蛋白粉。

1.2.15 氨基酸組成分析 參照胡方園等［7］，采用OPA－FMOC柱前衍生化法對酶解產物氨基酸組成進行分析。

1.2.16 蛋白分子量分布的測定 參照胡方園等［7］，采用HPSEC凝膠過濾色譜法對酶解產物的分子量分布進行分析。

2 結果與討論

2.1 酶解條件的優化

2.1.1 加酶量對蛋白水解度的影響在木瓜蛋白酶的不同添加量下，對魚肉水解的影響見圖1。從圖中可以看出，蛋白水解度隨著酶添加量的增大呈現出先增大后穩定的趨勢。當加酶量為4000U/g蛋白質時，水解度已達到23.29%，酶濃度達到飽和;即使加酶量加大到7000U/g蛋白質，水解度為23.80%，沒有明顯增加。這可能是因為，反應剛開始時酶促反應體系處于底物過量的狀態，所以水解度會隨著酶添加量的增大而增大;而隨著酶濃度的不斷增加，直到飽和，此時酶與底物已經完全結合，再增加酶也不能與底物結合，故酶濃度的增大對反應速度幾乎沒有影響，所以選定酶添加量為4000U/g蛋白質。

圖1 木瓜蛋白酶在不同加酶量時的水解度Fig.1 The degree of hydrolysis with Papain at different enzyme dosages

2.1.2 酶解溫度對蛋白水解度的影響 酶的最適溫度會隨著體系的改變而有所差異，對不同溫度下木瓜蛋白酶對魚肉蛋白水解度的影響所得到的結果如圖2所示。從圖中可以看出，當溫度低于50℃時，蛋白水解度隨著溫度的升高而增大，溫度大于50℃以后，隨著溫度的上升，水解度呈下降趨勢。這可能是由于溫度低于50℃時，溫度對酶促反應的影響更大，蛋白水解度隨著溫度的升高而增大;但當溫度超過50℃后，酶受熱變性的因素占優勢，最終使酶促反應速度下降。在50℃時，蛋白的水解度達到最大值，所以選定50℃為木瓜蛋白酶酶解白鰱魚蛋白的最適溫度。

圖2 木瓜蛋白酶在不同溫度時的水解度Fig.2 The degree of hydrolysis with different temperatures

2.1.3 pH對蛋白水解度的影響在不同pH下木瓜蛋白酶對魚肉蛋白水解度的影響結果見如圖3所示。從圖中可以看出，pH＜6.5時，水解度與pH呈正相關;當pH＞6.5時，水解度逐漸下降;因此，確定木瓜蛋白酶水解魚肉的最適pH為6.5。

圖3 木瓜蛋白酶在不同pH時的水解度Fig.3 The degree of hydrolysis with different pH

2.1.4 酶解時間對產物分子量分布的影響 在不同酶解時間(1、2、3、4、5、6、7h)下，水解產物經過噴霧干燥后的蛋白粉測定其分子量分布結果如圖4所示。從圖中可以看出，酶解1h得到的產物分子量＞1000的組分含量為14.22%，酶解2h的為13.72%，酶解3h的為11.21%，當酶解4h時，分子量＞1000的組分含量降低到9.10%，不同酶解時間得到的粉分子量差異顯著。但是當酶解4h時，分子量＜180的組分含量也從1h時的9.91%增大到了11.43%，再延長酶解時間，分子量＜1000的組分含量變化非常緩慢，因此，酶解時間定為4h。

圖4 不同酶解時間酶解產物分子量分布Fig.4 Molecular weight distribution of protein hydrolyzed by Papain with different time

2.1.5 底物濃度對蛋白水解度的影響 不同底物濃度對木瓜蛋白酶水解魚肉的效果影響結果如圖5所示。從圖中可以看出，隨著底物濃度的增大，木瓜蛋白酶對鰱魚蛋白的水解度有一定的增大，但是當底物濃度高于5.5%以后，水解度出現明顯下降。這可能是因為在一定的酶濃度下，當底物濃度較低時，反應速度與底物濃度的關系呈正相關;然而隨著底物濃度的不斷增加，酶的結合位點達到飽和，底物濃度再增加對反應速度已經幾乎沒有影響，但是底物濃度的增大同時會增加酶與蛋白特殊位點結合的空間位阻，從而導致酶促反應速度反而下降。可以得出，當底物濃度為5.5%時，木瓜蛋白酶對鰱魚蛋白的酶解效果最好。

圖5 木瓜蛋白酶在不同底物濃度時的水解度Fig.5 The degree of hydrolysis with different substance concentrations

2.2 噴霧干燥條件的優化

2.2.1 白鰱酶解液固形物含量對黏度的影響 對不同固形物含量下酶解液的黏度變化曲線見圖6。從圖中可以看出，酶解液的黏度隨著固形物含量的增加而增加。在酶解液固形物含量較低時，酶解液的黏度變化緩慢，當酶解液固形物含量達到25%后，酶解液黏度急劇增大。當固形物含量達到30%以后，酶解液的黏度達到3000mPa·s以上，高黏度通常在生產中會導致液體難以霧化。因此，將料液濃縮到25%～30%后進行噴霧干燥比較為宜。

圖6 白鰱魚酶解液黏度隨固形物含量的變化Fig.6 Changes of viscosity with the solids content

2.2.2 進料濃度的確定 將酶解液濃縮后噴霧干燥，不同濃度的酶解產物噴霧干燥后的蛋白粉品質見表1。從表中可以看出，隨著進料濃度的增加，產品水分含量逐漸下降，白度逐漸下降，堆積密度逐漸增大，流動性變好，分散性也越來越好。當進料濃度＞20%時，魚蛋白粉水分含量＜5%，而且魚蛋白粉的流動性得到改善，堆積密度增加。流動性的提高可能是因為高濃度物料有利于形成大粒徑的干燥顆粒［8－9］。堆積密度增大可能是由于進料濃度增大導致顆粒粒徑增大以及粒子間距離減小所產生的綜合效應。產品白度稍有下降，可能由外部過度干燥而引起［10］。

表1 進料濃度對魚蛋白粉各項指標的影響Table 1 The effect of different solids content on the various indicators of hydrolyzed protein powder from silver carp

2.2.3 進風溫度的確定 進風溫度對魚蛋白粉品質的影響見表2。由表中可知，隨著進風溫度由160℃升高到200℃，粉的白度由92.33下降到85.67，粉的分散性逐漸由不可測改善到59s，流動性由59.8s下降到26.6s，潤濕性由61s下降到26s，但溫度變化對堆積密度的影響不明顯。在相同進風量條件下，干燥室的溫度越高，物料進入降速干燥階段時間就越早，對應的干燥產品的含水量就越低，但是當進風溫度高于190℃時，影響蛋白粉品質。當進風溫度低于170℃時，魚蛋白粉的水分含量高于5%。因此，噴霧干燥進風溫度控制在170～180℃為佳。

表2 進風溫度對魚蛋白粉各項指標的影響Table 2 The effect of inlet air temperature on the various indicators of hydrolyzed protein powder from silver carp

2.2.4 進料速度的確定 進料速度對魚蛋白粉品質的影響見表3。由表中可知，隨著進料速度由6mL/min增加到14mL/min，產品的水分含量由3.06%升高到5.23%，堆積密度由0.235g/mL增加到0.313g/mL，休止角變從54.8°下降到41.2°，說明產品流動性變好，但是對白度的影響不明顯。這是由于進料速度直接影響出風溫度。進料速度越大出風溫度越低，而過低的出風溫度(過高的進料速度)將導致終產品水分含量高，分散性差，結團嚴重。但是出風溫度過高(進料速度過低)會使蛋白粉容易焦糊。綜合考慮，進料速度控制在10～12mL/min較適宜。

表3 進料速度對魚蛋白粉各項指標的影響Table 3 The effect of feed velocity on the various indicators of hydrolyzed protein powder from silver carp

2.3 酶法制備魚蛋白粉與均質魚蛋白粉的品質比較

將酶法制備魚蛋白粉與均質魚蛋白粉的品質進行比較，結果見表4。由表中可以看出，酶法制備魚蛋白粉的品質明顯優于均質魚蛋白粉。酶法制備魚蛋白粉的溶解度達到98.52%，明顯高于均質魚蛋白粉的37.23%。酶法制備魚蛋白粉的分散性和潤濕性有了很大的提高，分散性從無法分散提高到70s，潤濕性從262s提高到40s。

表4 酶法制備魚蛋白粉與均質魚蛋白粉的品質比較Table 4 The difference of hydrolyzed protein powder and protein powder

2.4 魚蛋白粉氨基酸組成

酶法制備魚蛋白粉與均質魚蛋白粉的氨基酸組成見表5。由表中可知，酶法制備魚蛋白粉的氨基酸組成優于均質魚蛋白粉。酶法制備魚蛋白粉的必需氨基酸含量達到40%以上，超過 FAO/WHO/UNU(2007)推薦值，可以作為很好的蛋白質配料。魚蛋白粉中賴氨酸含量較高，適合添加在我國大部分人口的谷物食物中以補充賴氨酸，同時還可以提高食物蛋白質的吸收和利用，達到均衡營養，促進生長發育的目的。此外，魚蛋白粉中組氨酸含量較高，可以考慮將其添加在嬰幼兒食品中。

表5 兩種魚蛋白粉的氨基酸組成比較(g/100g蛋白質)Table 5 The comparison of amino acid composition of hydrolyzed protein powder and protein powder(g/100g protein)

3 結論

3.1 白鰱魚采肉后經打漿被木瓜蛋白酶酶解，在溫度50℃、加酶量4000U/g蛋白質、底物濃度為5.5%、pH6.5、時間4h的工藝條件下魚蛋白質的水解度達到29.82%，其中相對分子量1000以下的組分占90.90%。

3.2 白鰱魚蛋白酶水解液經濃縮至25%～30%后，采用噴霧干燥控制進風溫度170～180℃、出風溫度80～90℃，所制備的魚蛋白粉產品呈乳白色，流動性好、易潤濕，溶解度達98.52%。

3.3 酶法制備的鰱魚蛋白粉魚蛋白粉必需氨基酸含量達到40%以上，賴氨酸含量較高，是一種營養價值高的優質蛋白，可作為蛋白質功能性食品配料。

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