超高效液相色譜法快速測定水產(chǎn)品中藥物殘留

貝亦江，王 揚(yáng)，何 豐，吳 瑩

(1.浙江省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，浙江杭州 310012;2.浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江杭州 310018)

四環(huán)素類藥物由放線菌產(chǎn)生，主要包括土霉素、四環(huán)素、金霉素及半合成的抗生素，屬廣譜抗生素。由于其具有良好的殺菌抑菌作用，作為藥物添加劑被廣泛應(yīng)用于防止動(dòng)物及水產(chǎn)品的疾病感染。若不合理地使用四環(huán)素類藥物，易誘導(dǎo)耐藥菌株，并在食物中殘留，長期食用含有這類藥物的動(dòng)物產(chǎn)品及其制品會(huì)嚴(yán)重危害人體健康。

各國針對進(jìn)出口動(dòng)物組織及相關(guān)產(chǎn)品中的四環(huán)素類藥物殘留量做出了最高殘留量規(guī)定，并且建立了多種檢測方法:微生物法、放射免疫檢測法、金標(biāo)快速檢測試紙法、酶聯(lián)免疫吸附測定法、薄層色譜法、HPLC法、UPLC法及LC-MS法等。其中，微生物法的原理及操作簡單，但檢測時(shí)間長、靈敏度低、特異性差、易干擾;放射免疫檢測法存在放射性污染和標(biāo)記物不穩(wěn)定等問題，應(yīng)用較少;金標(biāo)快速檢測試紙法操作簡單、快捷，雖重復(fù)性和穩(wěn)定性好，但靈敏度較差;酶聯(lián)免疫吸附測定法操作方便，儀器簡單，靈敏度高，專屬性強(qiáng)，適用于大批量樣品的檢測分析，廣泛應(yīng)用于動(dòng)物性食品中四環(huán)素類藥物的檢測，但檢測結(jié)果存在一定的假陽性，且只能測定四環(huán)素類藥物的總殘留量;薄層色譜法檢測方法簡便、快速，且不需復(fù)雜儀器，廣泛應(yīng)用于快速定性檢測，但分辨率和靈敏度較低;HPLC法可進(jìn)行準(zhǔn)確定量測定，具有高效、快速、靈敏度和檢出限高的優(yōu)點(diǎn)，在對同類藥物多殘測方法中精密度好，回收率高，可廣泛應(yīng)用于動(dòng)物性產(chǎn)品中抗生素殘留量的監(jiān)測和監(jiān)控，但不能準(zhǔn)確定性，尤其是對違禁藥物的定性檢測;LC-MS法是所有檢測方法中提供信息量最多的一種檢測方法，既可準(zhǔn)確定量，又可準(zhǔn)確定性，靈敏度高，但通常樣品前處理較復(fù)雜，且儀器昂貴，因此不易推廣應(yīng)用。

本研究采用了四環(huán)素類快速檢測前處理試劑盒中提取劑提取樣品中的有效成分，再用固相萃取法進(jìn)行凈化，最后用超高效液相檢測分析，從而同時(shí)檢測出四環(huán)素、土霉素、金霉素3種四環(huán)素類抗生素的殘留。結(jié)果表明，運(yùn)用SPE凈化樣品，減少了樣品中的雜質(zhì)對儀器產(chǎn)生的污染，提高了分析物的回收率，更有效地將分析物與干擾組分分離，減少樣品預(yù)處理過程，結(jié)果重現(xiàn)性較好，操作簡單，省時(shí)省力。運(yùn)用UPLC檢測分析，縮短了分析時(shí)間，檢測的靈敏度較高，并且儀器的專屬性強(qiáng)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

主要儀器有Waters Acquity UPLC超高效液相色譜儀配二元泵，在線脫氣機(jī)，自動(dòng)進(jìn)樣器，PDA檢測器;Sartorius 2202S型電子天平，Waters Oasis HLB固相萃取小柱，THERMO MEGAFGE11R高速冷凍離心機(jī)，pHB-1便攜式酸度計(jì)，THZ-92C氣浴恒溫振蕩器。

主要試劑包括金霉素標(biāo)準(zhǔn)品 (純度92.5%)，四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品 (純度97.0%)，土霉素標(biāo)準(zhǔn)品 (純度89.9%)，甲醇、乙腈、三乙胺均為色譜純，磷酸、三水合乙酸鉛為分析純。

提取劑包括四環(huán)素、沙星類快速檢測前處理試劑盒 (北京六角體科技發(fā)展有限公司)。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別稱取金霉素、四環(huán)素、土霉素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用甲醇溶液溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中，配置成100μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。于0～4℃避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。分別移取5 mL金霉素、四環(huán)素、土霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于50 mL棕色容量瓶中，混合均勻，并用甲醇定容，配置成金霉素、四環(huán)素、土霉素均為10μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于0～4℃避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作液。吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)中間液，用流動(dòng)相稀釋至1.00 mL，配制成0.05，0.10，0.50和1.00μg·mL-1系列梯度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2 色譜條件

色譜柱:Waters BEH C18色譜柱 (100 mm×2.1 mm，1.7μm);流動(dòng)相:0.05 mol·L-1磷酸/三乙胺緩沖液 (pH值 2.4)+乙腈 (V∶V為80∶20);流速0.3 mL·min-1;柱溫:35.0℃;檢測波長355 nm;進(jìn)樣量10μL。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

取新鮮或冷凍的組織，去除脂肪和筋膜，魚肉、龜鱉肉去皮，蝦、蟹去殼，絞碎均質(zhì)。

1.3.2 樣品提取

稱取樣品5.00 g于50 mL離心管中，分別加入不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。加入提取劑10 mL，漩渦振蕩3 min，9 000 r·min-15℃冷凍離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一支50 mL離心管中，再向樣品中加入10 mL提取劑，重復(fù)提取1遍，合并上清液。向上清液中加入0.05 g的乙酸鉛，漩渦振蕩 2 min，9 000 r·min-15℃冷凍離心15 min，取10 mL備用。

1.3.3 樣品凈化

Waters Oasis HLB固相萃取小柱依次用5 mL甲醇、5 mL提取劑活化。待活化液流至填料上層以下，加入樣品提取液以2～3 mL·min-1速度過柱，棄廢液。待樣品提取液全部流出后用5 mL蒸餾水淋洗固相萃取柱，待淋洗液全部流出后，抽真空5 min。用0.8 mL甲醇洗脫，洗脫液收集于15 mL玻璃離心管中，40℃氮?dú)獯蹈伞堅(jiān)尤? mL流動(dòng)相漩渦振蕩2 min，過0.22μm濾膜后待測。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品添加的回收率

土霉素回收率在80.00%～93.40%，四環(huán)素回收率在82.08%～97.60%，金霉素的回收率在69.00% ～80.96%，金霉素回收率最低 (表1)。在試驗(yàn)過程中金霉素的損失較多，由于其化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，見光易分解，因此在有光的環(huán)境下進(jìn)行試驗(yàn)得到的回收率低。

2.2 方法的線性及相關(guān)系數(shù)

0.05 ，0.10，0.50，1.00 μg·mL-1系列標(biāo)準(zhǔn)工作液按濃度從低到高以1.2色譜條件分析，按所得峰面積的平均值與對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，3種樣品濃度在0.05～1.00μg·mL-1的范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。

表1 不同組織樣品添加的回收率

土霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1.42 e+004 x-1.56 e+002，r=0.999 5。

四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1.83 e+004 x-2.60 e+002，r=0.998 8。

金霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線y=2.36 e+004 x+1.41 e+002，r=0.999 9。

2.3 樣品前處理方法的優(yōu)化

試驗(yàn)的提取、凈化的方法根據(jù)四環(huán)素、沙星類快速檢測前處理試劑盒中動(dòng)物源食品的快速測定方法來進(jìn)行并優(yōu)化。由于魚肉含有大量的粗蛋白，在離心機(jī)中難以較好地離心，會(huì)出現(xiàn)大量的渾濁液。因此，試驗(yàn)中使用了9 000 r·min-15℃冷凍離心15 min，提高轉(zhuǎn)速，降低溫度，并延長離心時(shí)間，使提取液較為清透，為下一步的固相萃取奠定了良好的基礎(chǔ)。在上清液中加入乙酸鉛是運(yùn)用酸沉法，由于四環(huán)素類抗生素在生物樣品中易與蛋白質(zhì)強(qiáng)烈結(jié)合，因此，常用強(qiáng)酸或酸性脫蛋白及從生物樣中提取而起到沉淀蛋白的作用。

2.4 固相萃取柱的選擇

試驗(yàn)采用Waters Oasis HLB 3 mL(60 mg)的固相萃取柱，由于HLB柱子無需經(jīng)過繁瑣的過柱及蒸發(fā)濃縮過程，提取液無需調(diào)節(jié)pH值，且吸附容量高，萃取效果也好。

2.5 流動(dòng)相的選擇

本試驗(yàn)使用的流動(dòng)相為0.05 mol·L-1磷酸/三乙胺緩沖液 (pH 值2.4)+乙腈 (80∶20，V∶V)，乙腈的洗脫能力強(qiáng)，能有效除去色譜柱中殘留的雜質(zhì)，加入了少量的酸，是為了增加離子化效率，提高儀器的靈敏度。

2.6 檢測波長的選擇

土霉素、四環(huán)素、金霉素3種抗生素在260和355 nm 2個(gè)波長附近都有吸收峰，在260 nm附近的吸收最大，但因?yàn)殡s質(zhì)在短波長吸收較大，因此選擇了355 nm為3種抗生素共同的檢測波長。

3 小結(jié)

試驗(yàn)采用四環(huán)素、沙星類快速檢測前處理試劑盒中的提取劑及方法，并在試驗(yàn)方法上做了優(yōu)化，更好地提取樣品中的有效成分，同時(shí)大大提高了的提取效率，較其他不同試劑大大縮短了時(shí)間。采用SPE凈化法，減少了樣品中的雜質(zhì)對儀器產(chǎn)生的污染，為下一步進(jìn)樣檢測制造的良好前提條件，提高了分析物的回收率，有效地將分析物與干擾組分分離，結(jié)果重現(xiàn)性較好，減少了樣品預(yù)處理過程，操作簡單，省時(shí)省力，使用UPLC檢測快速準(zhǔn)確。綜上，本試驗(yàn)大大縮短了試驗(yàn)時(shí)間，提高了試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，使檢測結(jié)果獲得了良好的回收率。

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