健康和蟲害的紅松揮發物對赤松梢斑螟及其寄生蜂寄主選擇行為的影響

王 琪,嚴善春,嚴俊鑫,徐 波

(1. 東北林業大學林學院林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040; 2. 黑龍江省森林保護研究所，哈爾濱 150040； 3. 黑龍江省林科院博士后科研工作站，哈爾濱 150040；4. 國家林業局森林病蟲害防治總站，北京 110034)

健康和蟲害的紅松揮發物對赤松梢斑螟及其寄生蜂寄主選擇行為的影響

王 琪1,2,3,嚴善春1,*,嚴俊鑫1,徐 波4

(1. 東北林業大學林學院林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040; 2. 黑龍江省森林保護研究所，哈爾濱 150040； 3. 黑龍江省林科院博士后科研工作站，哈爾濱 150040；4. 國家林業局森林病蟲害防治總站，北京 110034)

為了研究紅松球果害蟲赤松梢斑螟Dioryctriasylvestrella及其寄生蜂的寄主趨向機理，用Y型嗅覺儀測定了赤松梢斑螟成蟲及其寄生蜂長距繭蜂Macrocentrussp，對紅松健康和梢斑螟幼蟲危害的球果、主梢及側枝的晝夜行為反應；并用GC-MS分析了健康和蟲害球果、主梢及側枝晝夜所釋放揮發物的組份及含量變化。結果表明，赤松梢斑螟處女雌蛾、交尾雌蛾和雄蛾在夜晚對健康球果及主梢有較強的趨性。雌雄長距繭蜂白天對蟲害紅松球果、主梢有較強的趨性。紅松各部位揮發物成分及含量在健康與蟲害、白天與夜晚之間存在顯著差異，主要表現為單萜類物質相對含量顯著變化，如α-蒎烯、莰烯、β-水芹烯、β-蒎烯、3-蒈烯、羅勒烯、β-月桂烯、檸檬烯，以及產生特異性倍半萜類揮發物，如乙酸龍腦酯、石竹烯等。其中紅松各部位單萜類揮發物含量變化是影響赤松梢斑螟及其寄生蜂的寄主選擇行為的主要原因；而特異性倍半萜單體或組合，是否能夠作為產卵刺激劑，協同單萜類揮發物調控二者的產卵行為，還需要試驗的進一步證明。

紅松；揮發物；赤松梢斑螟；長距繭蜂；行為反應；化學分析

紅松(Pinuskoraiensis)是我國東北長白山和小興安嶺一帶的珍貴樹種，具有保持水土、改良氣候的作用，其針葉、花粉、種子也具有極高的經濟價值和保健作用。近幾年，因各地區大力種植紅松人工林，改變了林分組成，擴大了紅松純林分布面積，赤松梢斑螟(Dioryctriasylvestrella)的危害也日趨嚴重。赤松梢斑螟主要危害紅松主梢和球果，常導致紅松種子的質量和產量大幅下跌、樹干分叉，材質和出材率明顯下降。由于赤松梢斑螟幼蟲生活隱蔽，且成蟲羽化不整齊，目前尚無有效方式對其進行防治[1]。

以揮發物為基礎的植食性昆蟲與植物相互關系，是當前昆蟲學較活躍的研究領域之一，并已經成為害蟲危害習性中不可缺少的一部分[2]。蟲害誘導的植物揮發物多具有明顯的晝夜變化，或僅表現為白天釋放的特點[3- 4]。煙草受煙芽夜蛾(Heliothisvirescens)危害后，白天和夜間揮發物的組成和含量顯著不同[5]。

本研究測定了赤松梢斑螟及其寄生蜂長距繭蜂(Macrocentrussp.)成蟲對紅松健康球果、主梢、側枝及梢斑螟幼蟲危害后的球果、主梢、側枝的行為反應，并利用動態頂空取樣法收集了紅松健康及被害后各部位晝夜釋放的揮發物，并用GC-MS分析了揮發物的成份及其相對含量。以期探明球果、主梢、側枝揮發物的晝夜變化，以及揮發物對梢斑螟及其寄生蜂寄主選擇的影響，從而進一步明確梢斑螟及其寄生蜂在尋找寄主過程中所利用的揮發性信息化合物的來源及其作用。

1 材料和方法

1.1 供試昆蟲及紅松樣品

2010年4月末，在牡丹江林口林業局刁翎林場40年生紅松人工林采集帶有赤松梢斑螟、長距繭蜂的紅松枝條，于(27±1)℃室溫條件下置于60目養蟲網內水培，濕度控制在(60 ± 5)%，2010年6月中旬待赤松梢斑螟成蟲羽化后以5%蜂蜜水補充營養，控制其交尾備用。長距繭蜂成蟲羽化后不進行營養補充即交尾[6]，取交尾后雌雄蜂用于行為反應試驗。6月末，在紅松人工林內隨機選擇紅松樣樹，分別在7:00，19:00，采集健康及被害紅松球果、主梢、側枝，用于揮發物成分鑒定及生物測定。

1.2 行為生物測定

1.2.1 “Y”型嗅覺儀生物測定

取羽化3 d的處女雌蛾、交尾雌蛾、未交尾雄蛾，及長距繭蜂交尾后的雌雄成蟲，測試其對紅松晝夜揮發物的行為反應，生物測定裝置參照劉英勝等[7]改進，“Y”型管兩側臂等長20 cm，夾角75°，內徑2.5 cm；適應臂長20 cm，內徑3 cm；兩側臂磨砂口連接三角形陷阱，陷阱底部直徑8 cm。用硅膠管依次連接三角形陷阱、氣體采樣儀(QC-1 B型，北京市勞動保護科學研究所)及活性炭空氣過濾裝置。整個試驗溫度為28—30 ℃、光強4—6 lx，氣體采樣儀的氣體流量為400 mL/min。

生測行為標準參照Natale等[8]和Tooker等[9]。在7:00，19:00開始進行梢斑螟行為測定，均持續3 h。取成蟲從引蟲口單只引入。在5 min內成蟲進入處理臂或對照臂超過2.5 cm，并保持1 min，則判定對臂內揮發物有趨向或驅避反應，否則為無反應。每一次測試完成后測試臂和對照臂互換。所有供試的成蟲只使用1次，紅松每個部位共測試15頭成蟲，每5頭為1個重復，設3個重復。每個重復測試完成后，用無水乙醇清洗嗅覺測定儀內壁，然后用蒸餾水沖洗，自然晾干以消除殘留氣味，進行下一組試驗。長距繭蜂行為測定方法同上。

1.2.2 數據分析

誘捕率=(處理臂內總蟲數/測試總蟲數)×100%[10]，以Duncan′s多重比較，分別分析紅松不同部位誘捕的同種同一性別成蟲誘捕率的差異顯著性，分析紅松同一部位所誘捕的，不同性別成蟲誘捕率的差異顯著性。

1.3 揮發物的采集與分析

1.3.1 揮發物的采集

試驗所需采樣罐為容積3.2 L內壁硅烷化的SiloniteTM采樣罐(美國ENTECH公司)，以高純氮清洗3遍，后抽成真空。用硅膠管依次連接蘇瑪罐，聚四氟乙烯塑料袋密封的植物材料，氣體采樣儀(QC-1 B型，北京市勞動保護科學研究所)及活性炭空氣過濾裝置。將采下的健康及被害紅松主梢、側枝、球果，用聚四氟乙烯塑料袋套在取樣部位(避開植物創口)，先將袋內的空氣吸出，后利用氣體采樣儀將過濾后的新鮮空氣充入袋內，平衡10 min，打開采樣罐閥門，待揮發物氣體充滿采樣罐后關閉閥門，標記后帶回實驗室待測，每一部位設3個重復。揮發物采集時間與Y型嗅覺儀行為測定時間保持一致。

1.3.2 揮發物的分析

將收集有紅松揮發物的采樣罐連接到7100A預濃縮儀上(美國ENTECH公司)，濃縮后的樣品進入GC17A/5973N(MS)氣質聯用儀，色譜柱為DB-5 石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 um)；載氣為高純氮氣，柱前壓6 kPa，進樣口溫度250 ℃，接口溫度250 ℃，分流比10∶1，進樣量0.2 μL；程序升溫：初始溫度40 ℃，以5 ℃/min的升溫速率升至90 ℃，再以8 ℃/min的升溫速率升至250 ℃，保持10 min。MS條件：EI電離，電子能量70 eV，離子源溫度200 ℃，掃描范圍m /z為10—400 amu，掃描時間0.14 s。

1.3.3 揮發物數據分析

將分離所得的紅松揮發性物質總離子流圖，采用Xcalibur軟件，通過查詢NIST 98.L譜庫，結合色譜保留時間，進行成分鑒定。通過面積歸一化法計算每種揮發物的相對百分含量。以Duncan′s多重比較分析紅松不同部位釋放的同種揮發物揮發量的差異顯著性。以配對t檢驗分析白天、夜晚之間同種揮發物揮發量的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 赤松梢斑螟及其寄生蜂對紅松不同部位揮發物的趨向反應

白天赤松梢斑螟成蟲行為反應較弱，紅松各部位對其誘捕率均在30%以下。夜晚時，3種赤松梢斑螟的選擇性較強，誘捕率均顯著高于白天(Plt; 0.05)(圖1)。夜晚健康球果和健康主梢對處女雌蛾、交尾雌蛾的誘捕率最高，且兩個部位對兩種雌蛾的誘捕率無顯著差異。受害球果對處女雌蛾、交尾雌蛾的誘捕率顯著低于健康的球果和主梢，且對處女雌蛾的誘捕率顯著低于交尾雌蛾。被害主梢、健康及被害側枝對兩種雌蛾的誘捕率均在 30%以下(圖1)。在所測試的6個部位中，健康主梢對雄蛾的誘捕率最高，其次為健康球果，其它部位對雄蛾的誘捕率均在30%以下。雌雄長距繭蜂在白天時的選擇性均顯著高于夜晚(Plt; 0.05)(圖1)。白天時，除健康主梢外，雌雄繭蜂對紅松各部位的選擇性無顯著差異。其中，雌雄繭蜂對受害球果、主梢及側枝的選擇性均較高，最高為受害主梢，其次為受害球果；對健康部位的選擇性顯著低于受害部位。夜晚時，雌雄繭蜂對紅松6個部位的選擇性均在30%以下(圖1)。

圖1 赤松梢斑螟、長距繭蜂晝夜對紅松各部位的選擇行為Fig.1 Behavioral response of D. sylvestrella and Macrocentrus sp. to different part of P. koraiensis during day and nightHC:健康球果；FC：蟲害球果；HT：健康主梢；FT：蟲害主梢；HB：健康側枝；FB：蟲害側枝; 圖中不同大寫字母表示紅松不同部位對同一性別成蟲誘捕率的差異顯著性P lt; 0.05; 不同小寫字母表示相同部位對不同性別成蟲誘捕率的差異顯著性P lt; 0.05

2.2 健康、被害紅松各部位揮發物種類及揮發量的晝夜差異

健康、被害紅松球果、主梢、側枝共鑒定出23種揮發物，但由表1可見，白天和夜晚，各部位揮發物的種類及揮發量存在差異，尤其是萜烯類揮發物的變化較顯著。夜晚，健康球果鑒定出20種揮發物組份，α-蒎烯、莰烯、β-水芹烯、β-蒎烯、3-蒈烯的揮發量顯著高于白天，莰烯、羅勒烯、β-月桂烯，1,3環己二烯、環己烯揮發量顯著低于白天；健康主枝夜間檢測到揮發物種類最少，只檢測到12種，α-蒎烯、β-蒎烯、羅勒烯、1,4環己二烯、1,3環己二烯揮發量顯著低于白天，莰烯、β-水芹烯、環己烯揮發量顯著高于白天，3-蒈烯無顯著變化；健康側枝夜間檢測到17種揮發物，β-月桂烯、羅勒烯揮發量顯著高于白天，α-蒎烯、莰烯、β-水芹烯、β-蒎烯、3-蒈烯，以及側枝特有揮發物檸檬烯，其揮發量均顯著低于白天。

由表1可見，與健康紅松相比，被害紅松各部位釋放的萜烯類揮發物，除揮發量發生顯著變化外，還檢測到特異性揮發物組分。白天時，受害后球果所釋放的1,3,5-環庚三烯、α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、1,3-環己二烯、環己烯揮發量顯著升高，羅勒烯、3-蒈烯揮發量顯著下降。被害主梢1,3,5-環庚三烯、羅勒烯、3-蒈烯揮發量下降，α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、1,3-環己二烯揮發量增加。此外，被害球果、主梢均檢測到乙酸龍腦酯、α-畢澄茄烯、古巴烯、萘、石竹烯等健康球果、主枝所沒有的倍半萜組分。被害側枝α-蒎烯、莰烯、β-水芹烯揮發量增加，羅勒烯、β-蒎烯、β-月桂烯、3-蒈烯揮發量下降，但并沒有檢測到特異性倍半萜。

表1 健康及蟲害紅松各部位揮發物晝夜含量變化

續表

主要組分Maincomponents保留時間Retentiontime/min采樣時間samplingtime相對百分比Relativepercentage/%HCFCHTFTHBFBAlpha-cubebene夜晚---0．04±0．01a-古巴烯Copaene14．083白天-0．18±0．06a?-0．10±0．08a0．06±0．03b-夜晚---0．19±0．03a0．07±0．00b0．13±0．01a?萘Naphthalene14．665白天-0．05±0．04a?-0．10±0．09a?--夜晚0．85±0．23a?-----石竹烯Caryophyllene14．801白天-0．67±0．06a?-0．29±0．04b?0．19±0．06b-夜晚1．72±0．25a?0．08±0．01d--0．21±0．09c0．78±0．11b?白天91．63±3．77a61．48±0．76c?76．18±9．55b?51．39±4．69d?97．71±4．71a?62．21±4．58c?夜晚92．20±4．81a74．56±1．64c39．65±1．92d37．35±2．10d73．43±7．91c85．46±4．66a

HC:健康球果；FC：蟲害球果；HT：健康主梢；FT：蟲害主梢；HB：健康側枝；FB：蟲害側枝; 不同小寫字母表示紅松不同部位釋放的同種揮發物揮發量的差異顯著性; *表示同種揮發物白天、夜晚之間揮發量的差異顯著性

夜間，對單萜類揮發物而言，被害紅松與健康紅松的揮發量存在差異，但其多種單萜類揮發物釋放量的變化趨勢，與白天健康及被害紅松之間單萜類對比的變化趨勢相同，只有少數幾種組分與之存在差異。如被害球果、主梢釋放的β-蒎烯、β-月桂烯，被害側枝所釋放的羅勒烯、3-蒈烯的變化趨勢，與白天相比存在差異。與白天被害紅松揮發物相比，夜間被害球果、主梢所檢測到的特異性倍半萜組分較少，球果只檢測到乙酸龍腦酯和石竹烯，主梢只檢測到α-畢澄茄烯和古巴烯，且除古巴烯外釋放量均小于白天。此外，被害側枝白天并沒有檢測到特異性倍半萜，但夜間卻檢測到乙酸龍腦酯、古巴烯和石竹烯3種倍半萜組分。

3 討論

梢斑螟幼蟲取食紅松，屬專食性植食昆蟲。結果可見，梢斑螟不但能夠準確識別寄主，并且能夠區分出寄主的不同部位。赤松梢斑螟處女雌蛾、交尾雌蛾和雄蛾，對寄主紅松的選擇性較高，并且明顯趨向于健康紅松球果和主梢。據研究報道，專食性植食昆蟲是根據特定的化學指紋圖譜對寄主植物進行準確定位[11]。本研究在測定健康及被害紅松球果、主梢和側枝的揮發物后發現，各部位揮發物的種類及揮發量存在差異，尤其是α-蒎烯、莰烯、β-水芹烯、β-蒎烯、3-蒈烯、羅勒烯、β-月桂烯、檸檬烯等單萜烯類揮發物的變化較顯著。許多研究表明它們都是影響和調節松科害蟲取食和產卵行為最為重要的信號物質[12- 14]。因此推測，單萜類揮發物含量變化，能夠明顯影響赤松梢斑螟寄主選擇行為。如檸檬烯是紅松側枝的特有成分，其揮發量較小。而行為反應測定也表明，雌雄赤松梢斑螟對側枝的選擇率均較低。在許多情況下正是這些少量的特異性揮發物，作為引誘或驅避劑調節植食性害蟲的行為反應[15]。檸檬烯很有可能作為驅避劑，調節梢斑螟成蟲的寄主選擇行為。

寄主揮發物不但能夠影響植食性昆蟲的寄主選擇，還會影響其寄生蜂的選擇定位[16- 19]。本研究中，長距繭蜂在白天對紅松揮發物較敏感，健康、被害紅松對雌蜂的誘捕率均在30%以上，尤其是受梢斑螟幼蟲危害的紅松，誘捕率達50%以上，說明紅松揮發物對長距繭蜂的寄主選擇行為有顯著影響。研究發現，健康桑枝對桑天牛長尾嚙小蜂(Aprostocetusprolixus)有顯著的引誘作用，其釋放的揮發物可以幫助長尾嚙小蜂找到其寄主棲境，但桑天牛危害的揮發物對其寄主定向的指導作用更大[20- 21]。松毛蟲赤眼蜂(Trichogrammadendrolim)明顯選擇被馬尾松毛蟲(Dendrolimuspunctatus)危害的馬尾松(Pinusmassoniana)針葉，且傾向于選擇被害程度嚴重的松針[22]。在對揮發物成分的進一步分析中發現，在受害紅松的球果、主梢揮發物中，多種單萜類物質揮發量發生顯著變化，并增加了乙酸龍腦酯、石竹烯、α-畢澄茄烯和古巴烯等倍半萜成分。因此推測，長距繭蜂除了受到單萜類揮發物的影響之外，還會根據受害紅松的特異性揮發物定位植食性昆蟲的棲境，從而找到幼蟲寄生。

植物揮發物的釋放具有一定的晝夜節律[3- 4,23]。昆蟲嗅覺識別系統與其特定的生態位是相互吻合的[22]。因此，植物晝、夜揮發物差異對植食性昆蟲、寄生蜂的寄主選擇具有顯著影響。煙草受煙芽夜蛾(Heliothisvirescens)危害后，白天和夜間揮發物的組成和含量顯著不同，白天煙草揮發物吸引天敵前來寄生，夜間煙草揮發物調控同種成蟲的寄主選擇[5]，這與本研究的結果一致。赤松梢斑螟主要在夜晚活動，在此期間健康球果、主梢揮發物中也檢測到了乙酸龍腦酯、石竹烯等倍半萜等成分。乙酸龍腦酯為美洲棉鈴蟲產卵定向物質之一[24]，且郭予元[25]認為，植物特異性的單萜類化合物主要吸引成蟲取食，而倍半萜類則有吸引成蟲產卵的作用。這些倍半萜類揮發物，是否與單萜類協同影響著梢斑螟的產卵選擇和寄生蜂的寄主定位，還需行為選擇試驗的進一步驗證。

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EffectofvolatilesfromhealthyorwormboredKoreanpineonhostselectivebehaviorofDioryctriasylvestrellaanditsparasitoidMacrocentrussp.

WANG Qi1,2,3，YAN Shanchun1,*，YAN Junxin1，XU Bo4

1KeyLaboratoryofForestryTreeGeneticImprovementandBiotechnologyofMinistryofEducation,NortheastForestryUniversity,Harbin150040,China2ForestProtectionInstituteinHeilongjiangProvince,Harbin150040,China3HeilongjiangAcademyofForestryPostdoctoralScientificResearchStations,Harbin150040,China4GeneralStationofForestPestManagement,StateForestryAdministration,Beijing110034,China

Dioryctriasylvestrella(Lepidoptera: Noctuidae) is a serious pest of the Korean pine (Pinuskoraiensis) which is the precious tree species in northeast China. It is a specialist feeder on the Korean pine and can`t complete its life circle on tree species other thanPinuskoraiensis. Common pest control measures such as spraying insecticides are normally not effective because their larvae feed inside the pine cones and shoots. Once outbreak, more than 85% trees could be damaged, which might result in significant reduction in seed production. Until now, there is no efficient and environment friendly pest control method to reduce the economic losses caused by this serious pest insect.Macrocentrussp. is a key larval parasitoid ofD.sylvestrellaand might play an important role in regulating its host population dynamics as a natural control agent.

Chemical signals play a major role in the orientation of insects to mates and suitable hosts. In this paper, we describe the diurnal behavioral responses of the adult moths and their parasitoid wasps toP.koraiensiscones, shoots and branches by using a Y tube olfactometer. Volatiles released during day and night from cones, shoots and branches of healthy andD.sylvestrellalarvae-damaged pine trees were collected and analyzed by GC-MS. The aim of the present study was to determine the diurnal pattern of volatiles released from cones, shoots and branches, and its potential effect on host-finding behavior ofD.sylvestrellaand the its parasitoidMacrocentrussp..

Y tube bioassay indicated that virgin, mated female moths and male moths responded strongly to volatiles released from the healthy pine cones and shoots during night. Mated females seemed also to respond to the larvae-damaged cones at night. Whereas the parasitic wasps (both sexes) were more responsive to volatiles released fromD.sylvestrellalarvae-damaged pine cones and shoots during the daytime. GC-MS analyses showed significant diurnal variations in volatile compositions and contents between healthy and damaged pine samples, and among the cones, shoots and branches, especially in the relative contents of major monoterpenes, including, α-Pinene, Camphene, β-Phellandrene β-Pinene, 3-Carene, Ocimene, Myrcene and D-limonene. D-limonene was only volatilized form lateral branches ofP.koraiensis, and the response ratio for males, virgin and mated females ofD.sylvestrellato lateral branches were significant lower than cones and tips. Thus, we assumed that D-limonene should play a special function onD.sylvestrellahost location of the adult moths. This function would be an important reason ofDioryctriaevading the lateral branchs ofP.koraiensis. Some specific sequiterpenes such as Bornylacetate and Caryophyllene were present mainly from theD.sylvestrellalarvae-damaged pine samples, which might function as repellent volatiles for the moth or attractant volatiles (synomone) for the parasitoid wasps. The host selection behaviors ofD.sylvestrellaand their parasitic wasps seemed to be regulated or influenced by the variations of monoterpene contents in the pine cones, shoots or branches. The exact functionality of these specific sesquiterpenes (individuals or in combinations) is not known; however, further study is surely needed to determine if these sesquiterpenes with or without monoterpenes might play a role in oviposition behaviors of bothD.sylvestrellaand their parasitoid wasps.

Pinuskoraiensis; volatiles;Dioryctriasylvestrella;Macrocentrussp.; behavioral response; chemical analysis

國家自然科學基金資助項目(30972375)；黑龍江省杰出青年基金資助項目(JC200802)；黑龍江省重點科技攻關資助項目(GA09B203-5)

2012- 08- 20;

2013- 04- 01

*通訊作者Corresponding author.E-mail: yanshanchun@126.com

10.5846/stxb201208201173

王琪,嚴善春,嚴俊鑫,徐波.健康和蟲害的紅松揮發物對赤松梢斑螟及其寄生蜂寄主選擇行為的影響.生態學報,2013,33(23):7437- 7444.

Wang Q，Yan S C，Yan J X，Xu B.Effect of volatiles from healthy or worm bored Korean pine on host selective behavior ofDioryctriasylvestrellaand its parasitoidMacrocentrussp..Acta Ecologica Sinica,2013,33(23):7437- 7444.