5種旋毛蟲(chóng)肌肉幼蟲(chóng)囊包玻片標(biāo)本制作方法的比較

劉潤(rùn)芳，張小娟，王新彩，祝曉瑩

旋毛形線蟲(chóng)簡(jiǎn)稱旋毛蟲(chóng)(Trichinella spiralis)，其成蟲(chóng)寄生在宿主的十二指腸和空腸上段，幼蟲(chóng)寄生在同一宿主的橫紋肌細(xì)胞內(nèi)，引起的旋毛蟲(chóng)病是一種重要的人畜共患寄生蟲(chóng)病。人食入含有活幼蟲(chóng)囊包的肉類及其制品而感染，從病人肌肉組織中查到旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)囊包是最準(zhǔn)確的診斷方法[1]。因此尋找快速、簡(jiǎn)便、有效的旋毛蟲(chóng)肌肉幼蟲(chóng)囊包標(biāo)本制作方法對(duì)旋毛蟲(chóng)病的診斷和人體寄生蟲(chóng)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)具有重要意義。 本文在對(duì)酸性和堿性溶液的濃度、溶液中染色劑的含量進(jìn)行調(diào)整的基礎(chǔ)上，采用不同濃度的醋酸卡紅、明礬卡紅、不染色5種方法對(duì)旋毛蟲(chóng)肌肉幼蟲(chóng)囊包進(jìn)行染色觀察比較。結(jié)果顯示，10%醋酸卡紅染色法或?qū)?5%醋酸卡紅原液稀釋100倍對(duì)標(biāo)本染色，均取得理想的染色效果。所以旋毛蟲(chóng)肌肉幼蟲(chóng)囊包永久性玻片標(biāo)本的制作可采用這兩種染色方法。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源旋毛蟲(chóng)陽(yáng)性鼠由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室王忠全教授、崔晶教授惠贈(zèng)。SPF小鼠購(gòu)于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將24只雌性小鼠隨即分為4組，每組6只，取含有旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)的小鼠肌肉壓片計(jì)數(shù)，每組分別喂飼的旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)數(shù)為50條/只，100條/只，150條/只、200條/只。在感染后45 d將小鼠斷髓處死，取咬肌、膈肌、舌肌、腹肌、肋間肌、前腿肌、后腿肌壓片，在顯微鏡下觀察旋毛蟲(chóng)囊包和囊內(nèi)幼蟲(chóng)的形態(tài)[2，3]。

1.2標(biāo)本固定將顯微鏡下觀察到的含有旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)囊包的小鼠肌肉壓片用棉線捆扎，置于70%酒精固定48 h。

1.3染色

1.3.110%醋酸卡紅染液(方法1) 用蒸餾水將方法2的染液稀釋1倍，分色時(shí)間延長(zhǎng)至35 min。其他方法同方法3。

1.3.220%醋酸卡紅染液(方法2) 配制染液時(shí)，將1 g卡紅加于冰醋酸20 mL和蒸餾水80 mL中，煮沸、過(guò)濾，直接用于標(biāo)本染色。分色時(shí)間延長(zhǎng)至20 min。其他操作步驟同方法3。

1.3.345%醋酸卡紅染液原液稀釋100倍染色(方法3) ①染色：將5 g卡紅加于冰醋酸45 mL和蒸餾水55 mL中，酒精燈加熱煮沸，過(guò)濾，密封保存。使用時(shí)取1份原液加99份蒸餾水稀釋，自酒精固定液內(nèi)取出標(biāo)本，打開(kāi)玻片，用手術(shù)刀片將肌肉小心刮下，在70%酒精中洗5 min，放入稀釋后的染液內(nèi)染色，染色時(shí)間18～24 h。②分色：2%鹽酸酒精分色2～3 min,70%酒精洗滌2次，每次2～3 min。③脫水：將肌肉標(biāo)本依次放入80%、95%、95%、100%乙醇中脫水各30 min。④透明：將標(biāo)本放入純酒精和二甲苯各50%的混合液中透明30 min，取出，放入純二甲苯透明30 min。⑤封片：用鑷子夾取肌肉標(biāo)本置于潔凈載玻片右側(cè)約1/3處，輕壓使肌肉標(biāo)本平整，在肌肉標(biāo)本處滴適量加拿大樹(shù)膠，加蓋玻片封片。

1.3.4明礬卡紅染色(方法4) ①染液配制：將1.5 g卡紅溶于3%鉀明礬水溶液中，煮沸15 min，輕輕攪拌使卡紅充分溶解，冷卻、過(guò)濾，加入幾滴甲醛。②染色：將保存于70%酒精的肌肉標(biāo)本依次浸入60%、50%、40%、30%酒精中逐漸退至蒸餾水中，每次30 min。將旋毛蟲(chóng)肌肉標(biāo)本浸于明礬卡紅標(biāo)本中過(guò)夜。③分色：將標(biāo)本自染色液中取出，用蒸餾水換洗2次，每次20 min，然后用2%鉀明礬水溶液分色30 min。④將肌肉標(biāo)本依次放入30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%乙醇中脫水各30 min。⑤透明：將標(biāo)本放入環(huán)保透明劑透明，隔夜。⑥封片：用鑷子夾取肌肉標(biāo)本置于潔凈載玻片右側(cè)約1/3處，輕壓使肌肉標(biāo)本平整，在肌肉標(biāo)本處滴適量加拿大樹(shù)膠，加蓋玻片封片。

1.3.5不染色標(biāo)本的制作(方法5) 將70%酒精固定好的肌肉標(biāo)本放入培養(yǎng)皿，加入純酒精和二甲苯各50%的混合液中透明30 min，取出，放入純二甲苯透明30 min，加拿大樹(shù)膠封片。

2 結(jié)果

2.1方法1制作的標(biāo)本(圖1A) 在光學(xué)顯微鏡下觀察，標(biāo)本顏色極淺，接近不染色標(biāo)本，肌纖維不太明顯，囊包輪廓清晰，囊內(nèi)幼蟲(chóng)立體感強(qiáng)，清楚可辨。

2.2方法2制作的標(biāo)本(圖1B) 標(biāo)本被染成深紅色，囊包與肌纖維界限清晰，囊內(nèi)幼蟲(chóng)著色較深，標(biāo)本不甚透明。

2.3方法3制作的標(biāo)本(圖1C) 標(biāo)本肌肉呈淡紫紅色，囊內(nèi)幼蟲(chóng)淡紅色，囊包壁顏色較淺，囊包與肌肉組織界限分明，標(biāo)本透明度較好。

2.4方法4制作的標(biāo)本(圖1D) 標(biāo)本肌肉組織被染成淡紫色，囊包和囊內(nèi)幼蟲(chóng)呈較深的紫色，囊包和肌纖維輪廓清晰，囊內(nèi)幼蟲(chóng)立體感欠佳。

2.5不染色標(biāo)本(圖1E) 囊包界限尚可，囊內(nèi)幼蟲(chóng)欠清晰。

A：方法1制作的標(biāo)本；B：方法2制作的標(biāo)本；C：方法3制作的標(biāo)本；D：方法4制作的標(biāo)本；E：方法5制作的標(biāo)本

3 討論

旋毛蟲(chóng)肌肉幼蟲(chóng)囊包永久性玻片標(biāo)本的制作方法有多種，但標(biāo)本的制作效果和溶液的種類、濃度，所采用染料的種類及其在溶液中的含量，染色過(guò)程中各個(gè)步驟時(shí)間的控制均有很大關(guān)系[4，5]。卡紅是從昆蟲(chóng)胭脂蟲(chóng)中提煉出來(lái)的一種粉末狀染料，可溶解于酸性或堿性溶液中。醋酸卡紅適宜于小型標(biāo)本的染色，滲透作用快,兼有殺死固定作用,且染色標(biāo)本不易褪色[6，7]。本次采用醋酸卡紅制作標(biāo)本過(guò)程中，45%的醋酸卡紅原液(含卡紅5 g)稀釋100倍、10%的醋酸卡紅染液(含卡紅0.5 g)制作的標(biāo)本囊包輪廓清晰，囊內(nèi)幼蟲(chóng)卷曲自然清晰、立體感強(qiáng)，效果較佳。只是前者稀釋倍數(shù)較大，染色較淡，所以適當(dāng)降低原液的稀釋倍數(shù)可取得理想的染色效果。20%的醋酸卡紅(含卡紅1 g)染液，溶液較濃，染色過(guò)深，雖延長(zhǎng)分色時(shí)間至40 min仍不能取得滿意染色效果。明礬卡紅染色力較弱，適合小型標(biāo)本的染色，沒(méi)有濃染之弊。在采用明礬卡紅染液染色過(guò)程中，作者用烷烴化合物類環(huán)保透明劑代替二甲苯進(jìn)行標(biāo)本的透明，結(jié)果標(biāo)本染色濃淡適中，囊包和肌纖維輪廓清晰，不足之處是囊內(nèi)幼蟲(chóng)立體感欠佳。由于二甲苯屬于中度毒性的化學(xué)試劑，長(zhǎng)期使用可對(duì)機(jī)體構(gòu)成危害[8，9]，所以，近幾年有人用環(huán)保透明劑替代二甲苯用于病理組織切片的制片過(guò)程[10]，但將環(huán)保透明劑應(yīng)用于寄生蟲(chóng)標(biāo)本制作尚未見(jiàn)報(bào)道。寄生蟲(chóng)標(biāo)本的制作過(guò)程與病理組織切片的制作有不同之處，旋毛蟲(chóng)肌肉幼蟲(chóng)囊包標(biāo)本采用的是肌肉組織壓片而非石蠟切片，所以對(duì)標(biāo)本的透明時(shí)間的長(zhǎng)短、是否會(huì)造成蟲(chóng)體和組織的破壞、標(biāo)本的長(zhǎng)期封固效果均有待進(jìn)一步觀察。

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