高效液相色譜法測定苦參栓的含量

楊曉暉，吳桐，左軍

(1．哈爾濱譽欣醫藥科技有限公司，黑龍江 哈爾濱 150086;2．黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

苦參栓的主要成分為苦參總堿，具有消炎、抑制細胞免疫和體液免疫的作用。采用苦參栓陰道給藥能加速糜爛面愈合，同時使宮頸分泌物減少，使創面修復及陰道流液時間明顯縮短。

其質量標準為國家藥品標準WS3－B－0094－89，其中含量測定采用滴定法，但是經過多次試驗發現所測得值很小，認為是方法本身存在問題，無法檢測本品種，所以擬采用準確度較高的高效液相色譜法進行本品的含量測定。本實驗對此方法進行驗證。

1 材料

1．1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(安捷倫1260型);賽多利斯BP211D分析天平;色譜柱(BDS，大連依利特，C18，250mm ×4．6mm，5μm);乙腈為色譜純;水為重蒸水;其余試劑均為分析純。

1．2 試藥 苦參栓(陜西摩美得制藥有限公司)。

2 實驗方法

2．1 色譜條件與系統適用性試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以0．2%磷酸－三乙胺－乙腈(98∶0．2∶2)為流動相;檢測波長為 210nm。理論板數按氧化苦參堿峰計算應不低于2000。

2．2 對照品溶液的制備 精密稱取苦參堿對照品、氧化苦參堿對照適量，分別加流動相使溶解，制成每1ml含苦參堿0．01mg，氧化苦參堿0．04mg的溶液，即得。

2．3 供試品溶液的制備 取本品10粒，切碎，混合均勻，精密稱定0．2g，置25ml容量瓶中，加甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，置冰水浴中30min使基質析出，濾過，放置室溫，精密量取續濾液1ml，加甲醇至15ml，混勻，通過中性氧化鋁柱(100～200目，5g，內徑1cm)，用甲醇30ml洗脫，收集洗脫液，80℃水浴蒸干，殘渣加流動相適量使溶解，并轉移至10ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2．4 測定法分別精密吸取上述對照品溶液與供試品溶液各20μl，注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖，按照外標法以峰面積計算苦參堿和氧化苦參堿含量的總和，即得。

3 方法學驗證

3．1 專屬性試驗

按照處方比例制備不加苦參總堿原料的空白陰性樣品，按上述含量測定方法進行操作，在上述色譜條件下進行測定。在該系統下苦參峰、氧化苦參堿的出峰位置上陰性樣品均沒有出現色譜峰，結果表明，本方法中，空白基質對含量的測定無干擾。

3．2 線性試驗

3．2．1 苦參堿的線性試驗

精密稱取苦參堿對照品約6mg，置10ml容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，再取1ml置25ml容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液，分別取0．5ml、1ml、3ml、5ml、7ml置 10ml容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，制備成苦參堿對照品溶液，分別吸取上述5種溶液及貯備液各20μl注入高效液相色譜儀中，照高效液相色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥD)測定，以苦參堿的質量為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程:Y=17095X－27.503，r=0．9999，苦參堿在 0．02 ～0．49μg 范圍內與峰面積呈良好的線性關系。結果見表1。

表1 苦參堿線性試驗結果

3．2．2 氧化苦參堿的線性試驗

精密稱取氧化苦參堿對照品約10mg，置5ml容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，再取1ml置25ml容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液，分別取 1ml、3ml、5ml、7ml置 10ml容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，制備成氧化苦參堿對照品溶液，分別吸取上述4種溶液及貯備液各20μl注入高效液相色譜儀中，照高效液相色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥD)測定，以氧化苦參堿的質量為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程:Y=14945X－6．5856，r=1．0，氧化苦參堿在 0．16 ～1．64μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系。結果見表2。

表2 氧化苦參堿線性試驗結果

3．3 定量限試驗

分別取已知濃度的苦參堿和氧化苦參堿對照品溶液用流動相進行一系列的稀釋，精密吸取各稀釋液20μl注入液相色譜儀，以信噪比10∶1的濃度為定量限度，測得苦參堿的定量限為3．11ng，氧化苦參堿的定量限為 9．07ng。

3．4 回收率試驗

取苦參堿對照品5mg，置100ml容量品中，加甲醇稀釋至刻度，作為苦參堿加樣對照品母液。取氧化苦參堿對照品5mg，置25ml容量品中，加甲醇稀釋至刻度，作為氧化苦參堿加樣對照品母液。精密稱取已知含量的樣品(陜西摩美得制藥有限公司，苦參堿含量10．75mg/g，氧化苦參堿含量 50．41mg/g)0．1g，共 9份，置25ml容量瓶中加甲醇適量使溶解，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻。至冰水浴中冷卻30min使基質析出，濾過，放置室溫，精密量取續濾液1ml，分別向其中加入苦參堿加樣對照品母液 0．8ml、1．0ml、1．2ml，再向其中加入氧化苦參堿加樣對照品母液0．8ml、1.0ml、1．0ml，分別制備成供試品溶液，使其濃度為正常量的80%、100%、120%，然后分別加甲醇至15ml，混勻，通過中性氧化鋁柱(100 ～200 目，5．0g，內徑1cm)，用甲醇30ml洗脫，收集洗脫液，80℃水浴蒸干，殘渣加流動相適量使溶解，并轉移至10ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，得續濾液，照高效液相色譜法(《中國藥典》2005年版一部附錄Ⅵ D)測定。并按照以下公式計算回收率。

結果:苦參堿平均回收率為 98．59%，RSD為1.6% ＜2．0%，氧化苦參堿平均回收率為99．17%，RSD為1．5% ＜2．0%，說明本方法測定樣品中苦參堿、氧化苦參堿含量的準確度良好。

3．5 中間精密度試驗

不同分析人員不同時間測定同一批樣品。結果:不同分析人員之間的RSD為0．47%，小于2．0%，說明本方法的精密度良好。

3．6 重復性試驗

分別精密稱取同一批樣品6份，按樣品含量測定方法測定，結果:平均二者含量總和為93．88mg/粒，RSD為0．47%，說明本方法的重復性良好。

3．7 溶液穩定性試驗

取樣品按照制備方法制備成供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12h 進行測定，考察供試品溶液主峰面積的變化情況。結果，12h內主峰面積的RDS均小于2．0%，說明樣品溶液在10h內穩定。

3．8 樣品檢測

分別取樣品按照上述方法進行測定，結果見表3。

表3 樣品含量測定

4 討論

本法采用HPLC法測定苦參栓中的含量，方法準確、方便、快捷，提高了苦參栓的質量控制方法，有利于栓劑在生產中的質量控制，提高產品的質量穩定性。