開心散改善Aβ1－42所致在體小鼠海馬LTP抑制的實驗研究

黃樹明，任麗民，李健英，張博，范越

(1．黑龍江中醫藥大學中醫藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040;2．黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

阿爾茨海默病(Alzheimers disease，AD)以記憶力減退、認知障礙、性格改變為主要臨床表現，其主要病理特征為腦內淀粉樣蛋白(amyloid beta peptide，Aβ)沉積并形成不溶性的老年斑(senile plaque)。現已明確，在老年斑形成之前小分子可溶性Aβ寡聚體就已對動物記憶的形成以及海馬長時程增強(long－term potentiation，LTP)產生抑制［1］，而海馬 LTP 的產生是記憶形成過程的關鍵環節。開心散始見于孫思邈的《備急千金要方》，由“遠志、人參各四分，茯苓二兩，菖蒲一兩”組成，為益智健腦之代表方劑。研究發現，開心散可改善癡呆動物模型記憶力［2］。本實驗采用活體動物海馬LTP的記錄，觀測在LTP被Aβ1－42抑制情況下，開心散的治療作用，以期闡明開心散改善AD患者記憶功能障礙的神經生理學基礎。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 動物分組

10周齡清潔級ICR小鼠，體質量25～35g，雌雄不限，60只。隨機分為正常對照組、Aβ組和Aβ加開心散組。Aβ組及Aβ加開心散組動物側腦室注射Aβ，對照組注入等體積生理鹽水。于實驗前2天給予Aβ加開心散組小鼠灌胃開心散0．3ml(含生藥量4g/ml)，每日1次，共計3天，空白對照組及Aβ組動物灌胃等體積生理鹽水。

1．1．2 實驗儀器

小鼠腦立體定位儀(NARISHIGE);刺激電極(鎢制同軸金屬電極);玻璃記錄電極(內充ACSF);放大器(DAM80);刺激裝置(NIHON KOHDEN);電刺激裝置(NIHON KOHDEN);數據獲取裝置(Molecular Device);動物恒溫系統(上海奧爾科特生物科技有限公司);跳臺實驗裝置(中國醫學科學院藥物研究所)。

1．2 方法

1．2．1 跳臺實驗

將小鼠放于跳臺裝置的金屬柵上，適應5min后，底部金屬柵通電，小鼠經電擊便躲避并最后跳上安全臺。如此反復訓練3次，記錄跳上安全臺的時間(跳上時間)。24h后將小鼠放在安全臺上，金屬柵通電，記錄小鼠第一次跳下平臺的時間(躲避時間)以及5min內小鼠從臺上跳下的次數(錯誤次數)。

1．2．2 海馬在體LTP記錄方法

小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(45mg/kg)麻醉后固定于腦立體定位儀上，切開頭部皮膚，暴露顱骨，在相應的位置(Bregma后1mm，旁開1.75mm)用骨鉆在顱骨上鉆孔。微量進樣器自腦表面垂直進針，深度為硬腦膜下1．8mm，將濃度為1μm 的 Aβ1－42緩慢注入側腦室5μl，注射經時10min，并留針10min以防液體外溢。實驗過程中用電熱毯維持動物體溫于37℃。

突觸后電位的記錄選擇貫通纖維束(Perforant pathway)－齒狀核(dentate gyrus，DG)通路。刺激電極的尖端定位在海馬Perforant pathway側枝處，坐標為Bregma后4．5mm、中線右側旁開3．0mm，深度為皮層下1.5～2．0mm;記錄電極尖端定位在DG區分子層，坐標為Bregma后2．1mm、中線右側旁開1．5mm，深度為皮層下1．8～2．2mm;參考電極固定于后頭部皮膚表面。以波寬為0．6ms，頻率為0．067Hz的電刺激誘發并記錄fEPSP，待基礎記錄穩定15min后，給予高頻刺激(High frequency stimuli，HFS)以誘發 LTP(100Hz，1sce)，然后連續觀察記錄90min。LTP以fEPSP鋒電位(population spike)振幅增加的百分比表示。

1．3 統計學處理

2 結果

2．1 Aβ及開心散對小鼠學習記憶功能影響的行為學檢測

通電后三組小鼠跳上安全臺的平均時間無明顯差異，即小鼠的基礎智力水平無差異。訓練24h后，與正常對照組相比，Aβ側腦室注射小鼠的躲避時間明顯縮短，同時錯誤次數明顯增多，統計學處理顯示兩個指標在兩組間均存在顯著差異(P＜0．01)，證明側腦室注射Aβ可以引起動物記憶功能的損傷。Aβ加開心散組與單純Aβ組相比，動物在安全臺上的躲避時間明顯延長(P＜0．05)，同時誤走下跳臺的錯誤次數也大幅減少(P＜0．05)，提示口服開心散可以改善Aβ誘導的動物記憶功能損傷。如表1所示。

表1 開心散對Aβ誘導的小鼠學習記憶功能的影響(±s)

表1 開心散對Aβ誘導的小鼠學習記憶功能的影響(±s)

注:與對照組比較，*P ＜0．01;與 Aβ 組比較，#P ＜0．05。

7 16．29 ±11．98 277．71 ±58．96 0．29 ±0．48 Aβ 組 8 12．87 ±10．00 57．88 ±48．59*1．75 ±0．70*Aβ 加開心散組 9 15．56 ±12．58 182．00 ±123．18#0．78 ±0．83錯誤次數對照組組別 n跳上時間(s)躲避時間(s)#

2．2 側腦室注射 Aβ1－42及灌胃開心散對小鼠海馬LTP的影響

海馬LTP的形成是記憶形成過程的關鍵步驟，前面行為學結果顯示，側腦室注射Aβ可誘發動物學習記憶功能障礙，而灌胃開心散可以逆轉此狀況，提示開心散可改善Aβ使神經細胞突觸傳遞LTP形成受到的抑制。因此用活體動物檢測了海馬LTP，結果表明，對照組、Aβ組及Aβ加開心散組小鼠海馬在給予高頻刺激HFS前的基礎刺激所誘發的EPSP波形并無差異。給予HFS后，在三組動物均觀察到LTP被誘發，表現為fEPSP波振幅和上升斜率增大。在HFS后90min時，對照組小鼠fEPSP鋒電位平均振幅比HFS刺激前增加(137．30±96．12)%，而Aβ組小鼠fEPSP鋒電位平均振幅增加(21．08±29．45)%，其增加幅度僅僅約為對照組的1/6，統計學處理顯示兩組間存在顯著性差異(P＜0．01)，提示Aβ通過抑制海馬神經元突觸的可塑性功能而抑制了小鼠的記憶及功能。Aβ加開心散組小鼠的fEPSP鋒電位平均振幅比HFS前增加(93．93±74．11)%，約為單純 Aβ 組的4.5倍，兩組間存在顯著差異(P＜0．05)。提示開心散可逆轉Aβ對海馬神經元突觸LTP形成的抑制，從而改善動物的記憶能力(見圖1)。

圖1 三組小鼠LTP比較

3 討論

AD以記憶力減退、認知障礙、性格改變為主要臨床表現。神經病理學上表現為腦皮質及海馬區Aβ沉積產生的老年斑和細胞骨架蛋白tau的高度磷酸化形成的神經纖維纏結以及大腦皮層和海馬區突觸形態改變及神經元丟失。其中Aβ的生成、代謝及其神經毒性是AD發病的關鍵關節。研究證實，Aβ寡聚體是一種神經毒素，可與神經突觸結合并阻礙其功能，引起記憶丟失和相關的神經損害。同時，電生理學研究證實，Aβ聚合成寡聚體后可直接對神經突觸傳遞可塑性產生抑制［3］。Aβ寡聚體對海馬神經元突觸信息傳遞LTP的抑制無疑是導致學習記憶功能障礙的關鍵環節［4－5］。

開心散具有開心益智之功。研究發現，開心散可以提高動物腦內膽堿能神經系統功能，提高AD動物模型學習記憶功能;可以增加腦組織中超氧化物歧化酶活性，清除體氧化物自由基，提高動物抗氧化應激能力［4］。但是至今為止，開心散改善Aβ誘導的動物學習記憶功能低下的神經生理學機制依然不清楚。研究表明，海馬神經元突觸信息傳遞的LTP是記憶形成過程中的關鍵環節，因此本研究采用行為學及電生理學活體記錄的實驗手段，探索了開心散改善AD病因蛋白Aβ誘導動物學習記憶功能障礙的的神經生理學機制。

實驗結果表明，側腦室注射Aβ1－42后，動物記憶功能明顯降低，同時其海馬神經元突觸傳遞LTP亦明顯受到抑制，說明Aβ通過抑制海馬LTP這一機制誘發動物記憶形成障礙。而口服開心散后動物在學習記憶功能得到恢復的同時，海馬LTP也明顯改善。本研究結果表明，開心散改善AD模型動物學習記憶功能的神經生理學機制是其阻斷了Aβ對中樞神經突觸信息傳遞LTP的抑制。

［1］ Balducci C，Beeg M，Stravalaci M，et al．Synthetic amyloid－beta oligomers impair long－term memory independently of cellular prion protein［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2010，107(5):2295－2300．

［2］ Nishiyama N，Zhou Y，Saito H．Ameliorative effects of chronic treatment using DX－9386，a traditional Chinese prescription，on learning performance and lipid peroxide content in senescence accelerated mouse［J］．Biol Pharm Bull，1994，17(11):1481－1484．

［3］ Walsh DM，Klyubin I，Fadeeva JV，et al．Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal longterm potentiation in vivo［J］．Nature，2002，416(6880):535－539．

［4］ 溫薇，金在順，周敏，等．開心散影響突觸可塑性的研究進展［J］．中醫藥學報，2010，38(2):140－141．

［5］ 李福東，王艷華，張超，等．開心散含藥腦脊液對無血清培養PC12細胞的促生長作用［J］．中醫藥學報，2012，40(6):12－14．