擬南芥ACOS5基因表達模式分析

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(上海大學 上海市能源作物育種及應用重點實驗室 上海200444)

0 引 言

擬南芥是一種十字花科植物,由于其基因組較小、生長周期短、容易種植等特點深受眾多研究學者喜愛,是當今生物學研究的熱門模式，為多數實驗室和研究機構的研究對象.花是植物中最后重要的器官之一,而花藥在植物花發育中占有重要地位[1].研究表明,擬南芥的花藥及小孢子發育在時空上受到精確調控,使花藥從分生組織逐步分化、成熟并最終釋放花粉[1-2].ACOS5是擬南芥花藥中特異表達的一種基因,該基因編碼一種脂酰輔酶A合成酶,該酶能夠在有輔酶A存在的情況下消耗ATP將肉桂酸、油酸等合成肉桂酰輔酶A和油酰輔酶A[3].其主要參與擬南芥花藥絨氈層的形成及發育,若該基因無意突變會直接導致擬南芥雄性不育[2-3].如果在模式植物擬南芥中能夠探明ACOS5的基因表達模式,將有助于在水稻、小麥等其他糧食和經濟作物中應用.

1 材 料

1.1 植物材料

擬南芥Columbia生態型,于人工光照溫室培養,培養條件為溫度22℃,16 h光照,8 h黑暗[4].定期進行澆水和營養液澆灌.營養液由上海永通化工有限公司生產.

2 方 法

2.1 基因組抽提

基因組抽提采用康為世紀植物復雜基因組抽提試劑盒進行抽提.

2.2 ACOS5啟動子克隆

自www.arabidopsis.org下載ACOS5啟動子序列,長度選取轉錄起始點至上游3Kbp.根據啟動子序列設計引物,上下游引物兩端分別加入HidIII和Sac1酶切位點.引物合成由上海生工生物工程公司進行合成.

引物序列為:上游(HindIII) CCCAAAGCTTGTAGAGGCTGAGAAATTGTA

下游(SacI) CGGAGCTCGATTTATGTGTTAGGAACAGGG

采用PCR方法對目的序列進行擴增,擴增采用takara公司生產的KOD PCR擴增試劑盒.PCR擴增參數為:

將所擴增的目的片段用taq酶進行加A,加A后進行膠回收操作.膠回收采用takara公司生產的膠回收試劑盒.

2.3 基因測序

將所回收得到的目的片段連入pMD18-T載體進行測序,該產品由TAKARA公司生產.測序公司為上海美吉生物醫藥科技有限公司.

連接體系(10 μL)如下:

Solution I內含T4 DNA連接酶,為試劑盒內配套試劑.

2.4 GFP基因克隆

實驗室自有GFP-T質粒.通過設計引物進行PCR,PCR產物回收加A后連入T載體進行測序.

引物序列為:上游(BamHI):CGCGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA

下游(SalI):GCGTCGACTTACTTGTACAGCTCGTCC

PCR擴增參數為

連接體系(10μL)如下:

挑選陽性克隆后送上海美吉生物公司進行測序.

2.5 表達載體構建

以下為實驗室自有p1300載體圖譜.

圖1 p1300載體多克隆位點示意圖

首先,將P1300載體以HindIII、SacI進行酶切并回收載體片段.然后,將測序正確的ACOS5啟動子以HindIII、SacI自T載體上酶切,并回收連入P1300載體中,并進行陽性克隆篩選和鑒定.將鑒定的載體以BamHI、SalI進行酶切,并回收載體片段備用.將測序正確的GFP基因以BamHI、SalI進行酶切并回收,隨后連入上述BamHI、Sal I處理的載體中并進行陽性克隆篩選和鑒定.

GFP連接體系(10 μL)如下:

ACOS5連接體系(10μL)如下:

將兩個目的片段分別連入p1300載體后挑選陽性克隆并抽提質粒進行酶切鑒定,剩余質粒備用.

2.6 轉化入農桿菌

將構建好的載體熱激轉化入農桿菌GV3101中.轉化方法詳見參考文獻[5-7].隨后進行農桿菌陽性克隆篩選及鑒定.

2.7 轉基因

將已轉入載體的農桿菌陽性克隆進行劃板、挑選單克隆、小型搖培(5 mL)、中型搖培(200 mL)后進行轉基因操作.轉基因具體步驟詳見參考文獻[5-8].

2.8 陽性苗篩選

轉基因植物轉化后3個月收集種子,對種子進行干燥.于50 μg/mL的潮霉素抗性平板上進行陽性苗篩選.并將所篩選到的陽性苗移出至人工光照培養箱進行培養.

2.9 熒光觀察

以蔡司LSM710共聚焦顯微鏡對篩選陽性苗進行熒光鑒定及表型觀察,并采用蔡司2.0圖形分析軟件對拍攝圖片進行熒光定量分析,統計不同時期花藥內GFP的表達情況.

3 結 果

3.1 啟動子克隆

將ACOS5啟動子、GFP基因測序結果在NCBI網站與原始序列進行比對,測序結果與原始序列完全匹配,無錯配、缺失等.

3.2 載體構建

對構建好的p1300陽性克隆進行質粒抽提和酶切鑒定.分別采用HindIII、SacI對ACOS5啟動子,BamHI、Sal I對GFP進行酶切鑒定,分別切出3Kbp條帶和750 bp條帶及剩余載體帶.鑒定結果如圖2,3所示:

圖2 ACOS5啟動子酶切鑒定

圖3 GFP酶切鑒定

3.3 轉基因植物鑒定

對篩選到的陽性苗基因組進行PCR鑒定,PCR擴增條帶包括GFP及ACOS5部分片段,長度約為450bp,抗性平板共篩選到15株陽性苗,經過PCR鑒定結果如下:

鑒定引物為:

F:CTATTTATATTCACTCTAGAG

R:GTACTCCAGCTTGTGCCCCA

圖4 轉基因植物PCR鑒定

3.4 熒光觀察

選取4號、6號轉基因植株進行傳代,在T3代通過抗性平板篩選分析,得到轉基因純合子.通過共聚焦顯微鏡對T3代轉基因植物進行觀察如圖四所示.同時對各個時期的熒光強度進行定量.結果顯示,轉基因植物花藥從四期開始微弱表達GFP,并在八期時表達最高,隨后逐漸減弱,至十二期時最弱.

圖5 共聚焦顯微鏡分時期觀察結果

圖6 分時期熒光定量結果

4 討 論

花粉和花藥的發育一直是現代植物學研究的熱點,其過程復雜,涉及多個基因的表達及調控.隨著分子生物學的不斷發展,植物學的研究也不僅僅局限于分類、組織器官的顯微觀察、解剖觀察等方法,而是越來越多地運用現代分子生物學手段對某些基因進行轉基因及表達模式分析,這些手段可以直接得到有力的生物學證據,并極大地推動植物花藥發育的相關研究.以本研究為例,本報告系統可以直觀地對ACOS5的表達模式進行分析,如對不同時期花藥中ACOS5的表達觀察與分析,并進行量化分析.通過對ACOS5的表達模式進行分析,可以發現該基因在花藥發育第八期表達最強烈.據此推測，該基因發揮主要作用的時期為第七到第八期,相關資料顯示[1-2],該基因突變會導致雄性不育,那么,可能其主要影響花藥發育第七到第八期時的花藥結構,使絨氈層完整結構不能建立[2-3],進而導致雄性不育.目前國內外著名學者多數以原位雜交來研究基因的表達模式[3],原位雜交具有一些如實驗周期長、不能活體觀察、經費開支大等缺點,而以GFP作為報告基因在操作上更方便,時間上更短,經費上更經濟,適合在擬南芥花藥研究中進行應用.

參考文獻:

[1] 戴文懿,孫亞梅,高貝,等.擬南芥溫敏雄性不育突變體atms1的獲得及表型分析[J].上海大學學報,2011,17(5):681-686.

[2] 何佳.調控擬南芥雄性不育基因MA的定位及擬南芥MtN3/saliva基因家族分析[D].上海：上海師范大學，2010.

[3] CLARICE A S,SUNG S K,STEFANIE K,et al.A Novel Fatty Acyl-CoA Synthetase Is Required for PollenDevelopment and Sporopollenin Biosynthesis in Arabidopsis[J].The Plant Cell,2009，21:507-525.

[4] 李俊華,張艷春,徐云遠.擬南芥室內培養技術[J].植物學通報，2004,21(2):201-204.

[5] JOSEPH S,DAVID W R.分子克隆實驗指南(上下冊)[M].黃培堂,譯.北京:科學出版社,2005:1012-1633.

[6] 張好富,張憲銀.一種不依賴于無菌培養的擬南芥活體轉基因種子篩選方法[J].浙江大學學報:農業與生命科學版，2009,35(4):372-376.

[7] 樊榮,萬小榮,張文濤,等.LE-ACS6啟動子在LE-ACS6::GUS轉基因擬南芥中的特異性[J].植物生理與分子生物學學報，2004,30(3):351-358.

[8] 張秀春,李文彬,夏亦薺,等.AtNUDT8過量表達的擬南芥轉基因植株[J].熱帶生物學報，2010,1(1):9-10.