副豬嗜血桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

涂玉蓉 李美娣 武 力

（廣州華農(nóng)大實驗獸藥有限公司 廣州 510642）

副豬嗜血桿菌（Hps）常引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎以及腦膜炎，由該菌引起的病又稱為豬革拉澤氏病［1］。隨著世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，該病已成為全球范圍內(nèi)影響?zhàn)B豬業(yè)的一種重要細菌性疾病。

副豬嗜血桿菌在實驗室分離培養(yǎng)困難，生長條件苛刻，需要高營養(yǎng)成分和特殊的生長因子煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，又稱輔酶Ⅰ）［2］。本研究在廣東地區(qū)分離獲得4株疑似細菌，通過形態(tài)觀察、培養(yǎng)特性和生化試驗對分離獲得的可疑菌株進行初步鑒定，結(jié)果表明成功分離到了4株副豬嗜血桿菌；藥敏試驗結(jié)果顯示，分離菌株對頭孢拉定、環(huán)丙沙星、恩諾沙星和菌必治等藥物敏感，為廣東省各豬場治療和預(yù)防該病提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 采自廣東省疑似副豬嗜血桿菌病豬場中具有典型病變患豬的內(nèi)臟組織、胸膜積液和心包液等。

1.1.2 主要試劑 胰蛋白大豆瓊脂（Tryptic Soy A-gar，TSA）和胰蛋白大豆肉湯（Tryptic Soy Broth，TSB）為廣州環(huán)凱生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；微量生化管和藥敏紙片均為杭州天和生物制品科技有限公司產(chǎn)品；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）和小牛血清均為北京鼎國生物技術(shù)公司產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離培養(yǎng) 無菌操作取肝臟、肺臟、脾臟、心臟、胸膜積液和關(guān)節(jié)液，無菌操作劃線接種于TSA平板上，37℃培養(yǎng)24～48 h，觀察結(jié)果；挑取疑似的單個菌落進一步純化培養(yǎng)。

1.2.2 染色鏡檢 將疑似菌株進行涂片、革蘭氏染色，然后于顯微鏡下觀察細菌的形態(tài)。

1.2.3 培養(yǎng)特性檢查 將分離的細菌分別接種于普通瓊脂、營養(yǎng)肉湯、含NAD的血瓊脂平板及添加了NAD和小牛血清的TSA平板，于37℃條件下培養(yǎng)24～48 h，檢查其在不同培養(yǎng)基上的生長表現(xiàn)、菌落特征及在含NAD血瓊脂平板上的溶血性等培養(yǎng)特性。1.2.4 生化試驗鑒定 將上述純培養(yǎng)物接種到含有V因子的TSB液體培養(yǎng)基中，200 r/min 37℃振蕩培養(yǎng)10 h后，往培養(yǎng)物中添加V因子溶液和血清，使兩者終濃度分別為0.01%和5%，輕輕混合均勻，吸取100μL混合液接種到生化管中，封蓋，置于37℃溫箱中培養(yǎng) 18～72 h 后，觀察結(jié)果［3］。

1.2.5 V因子依賴性 將上述純培養(yǎng)物分別接種含V因子和血清的TSB液體培養(yǎng)基和不含V因子的TSB液體培養(yǎng)基中，200 r/min 37℃振蕩培養(yǎng)10 h，對比觀察有無細菌生長。

1.2.6 衛(wèi)星現(xiàn)象檢查 無菌挑取純培養(yǎng)菌落，水平劃線接種于無V因子的綿羊血瓊脂平板上，再無菌挑取金黃色葡萄球菌作垂直劃線接種，37℃培養(yǎng)24 h后，觀察細菌生長情況。

1.2.7 藥敏試驗 用無菌棉簽蘸取分離菌的TSB液體培養(yǎng)基，均勻涂布接種于TSA平板，等干后，用無菌鑷子將各種藥敏紙片分別平貼于培養(yǎng)基的表面，于37℃條件下培養(yǎng)24～48 h，觀察、測定抑菌環(huán)的大小。判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌環(huán)直徑在15 mm以上的為高度敏感（青霉素高敏為20 mm以上）；10～15 mm為中度敏感；10 mm以下為低度敏感；無抑菌環(huán)的為不敏感。

2 結(jié)果

2.1 染色鏡檢結(jié)果 涂片并染色后顯微鏡下可見無芽孢和鞭毛，有莢膜的革蘭氏陰性細小桿菌。菌體形態(tài)多樣，短桿狀多見，也有球狀、桿狀和長絲狀，個別呈兩極濃染的球桿狀（見圖1）。

圖1 Hps革蘭氏染色鏡檢

2.2 分離培養(yǎng)及培養(yǎng)特性 在添加NAD和小牛血清的TSA平板上，37℃培養(yǎng)24～48 h后，生長良好，形成針尖大小、圓形、半透明及光滑濕潤的菌落（見圖2）。2.3 V因子需要試驗 將上述純培養(yǎng)物分別接種含V因子和血清的TSB液體培養(yǎng)基和不含V因子的TSB液體培養(yǎng)基中，200 r/min 37℃振蕩培養(yǎng)10 h，對比觀察有無細菌生長（見圖3）。Hps在含V因子的TSB液體培養(yǎng)基中呈云霧狀生長，而在無V因子的培養(yǎng)基中則不長。

圖2 Hps在TSA固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

圖3 Hps在TSB液體培養(yǎng)基中生長情況

2.4 衛(wèi)星現(xiàn)象 可見在金黃色葡萄球菌兩側(cè)有針尖大小、圓形、邊緣整齊的菌落生長，離金黃色葡萄球菌愈近菌落生長越好，愈遠菌落越小，呈現(xiàn)出明顯的“衛(wèi)星現(xiàn)象”；而未接種金黃色葡萄球菌的則不見細菌生長，進一步證實Hps依賴V因子生長（見圖4）。

圖4 衛(wèi)星現(xiàn)象

2.5 副豬嗜血桿菌藥敏試驗 試驗結(jié)果顯示，分離菌株對頭孢拉定、環(huán)丙沙星、恩諾沙星和菌必治等藥物敏感，見表1。

表1 藥敏試驗結(jié)果

3 討論

1）副豬嗜血桿菌是常規(guī)飼養(yǎng)豬群上呼吸道的一種常在菌，但是在特定條件下可以侵入機體并引起嚴重的全身性疾病，尤其在藍耳病暴發(fā)期間尤為嚴重，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失［4］。臨床上，副豬嗜血桿菌病的臨床癥狀和病理剖檢變化易與傳染性胸膜肺炎、鏈球菌病及巴氏桿菌病等混淆。所以，副豬嗜血桿菌的分離培養(yǎng)成為該病診斷的最可靠證據(jù)。

2）本研究從廣東省各地豬場收集病變典型病料，通過改良培養(yǎng)基營養(yǎng)成分（0.01%V因子鮮血培養(yǎng)基或含0.01%V因子及5%新生牛血清TSA）和培養(yǎng)環(huán)境，并根據(jù)Hps初次分離生長緩慢、菌落形態(tài)小等生長特性，采用二次觀察挑菌進行純培養(yǎng)，有效提高Hps分離率。根據(jù)分離菌的形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生化反應(yīng)、衛(wèi)星現(xiàn)象和V因子依賴性試驗結(jié)果，均符合副豬嗜血桿菌生物學(xué)特征，初步鑒定所分離的4株細菌均為副豬嗜血桿菌。

3）Hps血清型較多，目前報道有15種血清型，各型之間抗原交叉保護力比較低［5］。在不同的地區(qū)，其流行的血清型可能不同，一個豬場中經(jīng)常存在幾個菌株或幾個血清型，給疫苗免疫帶來困難。在藥敏試驗中，可根據(jù)高度敏感的藥物對相應(yīng)發(fā)病豬場進行藥物治療，由于副豬嗜血桿菌有15個血清型，不同菌株對同一種抗生素的敏感性存在很大差異，臨床用藥應(yīng)在分離菌株的藥敏試驗結(jié)果指導(dǎo)下進行。藥敏試驗結(jié)果顯示，分離菌株對頭孢拉定、環(huán)丙沙星、恩諾沙星和菌必治等藥物敏感，為廣東省各豬場預(yù)防和治療該病提供試驗依據(jù)。

［1］ O1vera A，Ca1samig1ia M，Aragon V.Genotypic Diversity of Haemophi1us parasuis Fie1d Strains［J］.App1ied and Environmenta1Microbio1ogy，2006，72：3984-3992.

［2］余小利，蘇丹萍，賀東生，等.副豬嗜血桿菌的分型研究進展［J］.廣東畜牧獸醫(yī)科技，2010（4）：13-16.

［3］ O1iveira S，B1acka11 P J，Pijoan C.Characterization of the diversity of Haemophi1us parasuis fie1d iso1ates by use of serotyping and genotyping ［J］.Am J Vet Res，2003，64（4）：435-442.

［4］ 葉飛，賀云霞，徐慧，等.副豬嗜血桿菌病研究進展［J］.動物醫(yī)學(xué)進展，2011，32（2）：101-104.

［5］ De1Rio M L，Gutieerrz C B，Rodriguez Ferri E F.Va1ue of indirect hemagg1utination and coagg1utination tests for serotyping Haemophi1us parasuis ［J］.J C1in Microbio1，2003，41：880-882.