聚乳酸/茶多酚復合納米纖維膜的抗菌機制及性能

費燕娜，高衛(wèi)東，王鴻博，王銀利

(1.生態(tài)紡織教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇無錫 214122;2.浙江朝暉過濾技術股份有限公司，浙江桐鄉(xiāng) 314500)

納米抗菌材料是在納米技術出現(xiàn)后，將抗菌劑通過一定的方法和技術制成納米級抗菌劑，再與抗菌載體通過一定的方法和技術制備而成的具有抗菌功能的材料。目前納米材料中，抗菌產品［1－3］及概念已成為其中最引人注目的應用領域之一［4－6］。納米抗菌纖維作為納米材料中一個重要的方面，也受到越來越多研究人員的關注。目前制備納米級抗菌纖維最常見的方法是將諸如銀、氧化鋅、甲殼素、二氧化鈦等無機天然光催化型抗菌劑與高聚物共混，通過靜電紡絲法制備出具有抗菌功能的納米纖維，并對其抗菌性能以及抗菌機制進行研究和探討［7－8］。王曦等［9］制備了含銀 PA6 納米纖維，分析了銀含量對抗菌效果的影響。XU等［10］制備了殼聚糖/聚乳酸復合納米纖維，研究了殼聚糖含量與抗菌效果之間的關系。茶多酚(TP)作為一種安全無毒副作用的綠色化合物，近年來已受到研究人員越來越多的關注［11－13］。本文將 TP作為抗菌劑，聚乳酸(PLA)作為載體，采用靜電紡絲法，制備PLA/TP復合納米纖維薄膜，分別采用抑菌圈法和振蕩燒瓶法對其進行定性和定量的抗菌性能檢測，并對其抗菌機理進行初步探討。

1 實驗部分

1.1 材料與設備

1.1.1 材料及試劑

茶多酚(TP)，純度98%，黃褐色粉末(江南大學食品學院);二氯甲烷(DCM)、N，N－二甲基甲酰胺(DMF)，分析純(國藥集團化學試劑有限公司);聚乳酸(PLA)切片，片材級，相對分子質量為10萬(深圳光華實業(yè)偉業(yè)有限公司)。

抗菌主要化學試劑:牛肉浸膏、生化試劑BR、氯化鈉，氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 (中國醫(yī)藥集團上海化學試劑公司);蛋白胨、瓊脂粉(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.1.2 靜電紡絲設備

WZ－50 C6型微量注射泵(浙江史密斯醫(yī)學儀器有限公司)，DW－P303－1ACD8 型高壓直流電源(天津東文高壓電源廠)，平板接收裝置(實驗室自制)。

1.2 實驗方法

1.2.1 紡絲液的制備

用電子天平稱取適量 PLA和 TP，溶于DCM、DMF的混合紡絲溶劑中。確定溶液中DCM和DMF的體積比為7∶3。本文實驗設定PLA與TP的質量比 分 別 為:100/0、90/10、80/20、70/30、60/40、50/50(W/W)。在室溫下磁力攪拌12 h，靜置備用。

1.2.2 靜電紡絲

將上述紡絲液倒入20 mL注射器中，采用內徑0.7 mm削平的注射針頭作為毛細管，調整注射器高度，使針頭高度與鋁箔接收板的中心位置在同一水平線上，二者之間的接收距離(C－SD)按需調節(jié)。注射泵連接高壓直流電源的正極，鋁箔接收板連接負極，溶液擠出量(紡絲速度)由注射泵控制可調，打開電源，按需要設定紡絲電壓。本文實驗中，紡絲工藝參數(shù)設定為:紡絲電壓18kV、紡絲速度0.6 mL/h、接收距離17 cm。

1.2.3 抗菌試樣制備

把待測試樣剪成直徑為25 mm的圓試樣(用于抑菌圈測試)及5 mm×5 mm小碎片(用于振蕩燒瓶法測試)若干，分別裝于三角錐形瓶內封口，由于被測試樣不適宜高溫滅菌，因此本實驗采用紫外燈光照30 min滅菌備用。

1.3 紅外光譜(FT-IR)觀察

用衰減全反射(ATR－Ge)制樣法，將聚乳酸納米纖維膜和不同質量混比的聚乳酸/茶多酚復合納米纖維膜分別制樣后進行紅外光譜掃描，進行比較分析。

1.4 抗菌性能測試

關于靜電紡納米薄膜的抗菌性能檢測，目前國內尚無統(tǒng)一的評價標準。由于聚乳酸/茶多酚復合納米纖維膜為一次性紡織纖維用品，因此本文實驗參照紡織品抗菌性能的評價方法，分別采用抑菌圈法和改良的振蕩燒瓶法對PLA/TP復合納米纖維膜的抗菌性能進行定性及定量的檢測。參照標準為GB/T 20944.1—2007《瓊脂平皿擴散法》、GB/T 20944.3—2008《振蕩法》以及 GB 15979—2002《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準》。實驗中所使用的2種菌種分別為:大腸桿菌(格蘭氏陰性菌代表，ATCC25922，E.coli);金黃色葡萄球菌(格蘭氏陽性菌代表，ATCC6538，S.aureus)。

1.4.1 抑菌圈法

在無菌培養(yǎng)皿中分別加入E.coli和S.aureus菌懸液，然后倒入冷卻至46℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，立即旋轉使其充分均勻分散，放置5 min待培養(yǎng)基凝結后，將直徑25 mm的試樣均勻的按壓在培養(yǎng)基中央，確保試樣和培養(yǎng)基充分接觸，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，觀察試樣周圍的細菌生長情況，測量抑菌圈尺寸。

抑菌圈評價:根據(jù)抑菌圈寬度以及試樣下方細菌的繁殖情況來判定抑菌效果的好壞。每個試樣至少測量3處，取平均值。抑菌圈大小可按式(1)計算:

式中:H為抑菌圈寬度，D為抑菌圈外徑的平均值，d為試樣直徑，單位均為cm。

1.4.2 振蕩燒瓶法

將試樣放入加有菌液的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，進行“0”接觸時刻取樣，按10倍稀釋法制作平皿，待瓊脂冷卻后放入37℃培養(yǎng)箱中，然后將裝有試樣和菌液的燒瓶放入搖瓶柜中，溫度設定為37℃，轉速為120 r/min，到規(guī)定時間后，取出燒瓶，按“0”接觸時刻平皿的制作方法制作平皿，冷卻后放入相同培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

抗菌效果評價:樣品的抗菌性能通過抑菌率進行判定，可按式(2)計算:

式中:XS為抑菌率;A為“0”接觸時刻平均菌落數(shù);B為樣品振蕩后平均菌落數(shù)。

1.5 抗菌機理

為探討TP的抗菌機制，采用H－7000型透射電鏡(日本HITACHI公司)分析經過PLA/TP復合納米纖維膜處理后的菌體，觀察TP加入對細胞超微結構的影響。

2 結果與分析

2.1 FT-IR分析

圖1示出不同混比條件下PLA/TP復合納米纖維膜的紅外光譜圖。

圖1 PLA/TP復合納米纖維膜FT－IR圖Fig.1 IR spectra of PLA/TP composed nanofibermembranes

通過分析圖1可得出以下2點結論:1)當PLA與TP混比為100/0時，紅外譜圖中在1 381 cm－1處出現(xiàn)甲基的變形振動吸收峰，但隨著TP含量的增加，當混比為 80/20時，這個吸收峰已右移至1 359 cm－1處，當TP含量繼續(xù)增加至二者比例為50/50時，已右移至1 339 cm－1處，這是由于PLA中的甲基結合TP中的苯環(huán)形成π－π共軛體系，由于共軛效應，使其電子云密度平均化，因此使吸收峰向低波數(shù)方向移動，同時由于受到氫鍵的影響，峰形有變寬的趨勢;2)隨著PLA/TP中TP含量的增加，PLA中出現(xiàn)苯環(huán)取代現(xiàn)象，當二者混比達到70/30時，從紅外譜圖可以很明顯地看出在1 613 cm－1處出現(xiàn)苯環(huán)吸收峰，當TP含量繼續(xù)增加，吸收峰也隨之增強，可以看到在60/40、50/50的紅外譜圖中分別在1 611 cm－1和1 558 cm－1處出現(xiàn)苯環(huán)吸收峰，同時在821 cm－1處出現(xiàn)了取代苯的特征吸收峰。綜上可知:以PLA為載體，TP為抗菌劑共混紡制的PLA/TP復合納米纖維薄膜中二者通過價鍵的結合很好地復合在一起。

2.2 復合膜的抑菌性

圖2(a)、(b)、(c)分別示出不同質量比條件下PLA/TP復合納米纖維膜對E.coli的抑菌效果。圖2(d)、(e)、(f)分別示出各試樣對S.aureus的抑菌效果圖。從圖2(a)、(d)中可以明顯看到沒有添加TP的純PLA納米纖維膜沒有抑菌圈，且試樣下方細菌的繁殖情況僅是輕微減少，因此可以判定純PLA納米纖維膜對E.coli和S.aureus沒有抗菌效果。當二者質量比為90/10時(見圖2(b)、(e))，可以看出試樣周圍仍然沒有抑菌圈，但試樣下方細菌繁殖情況明顯被抑制，僅有少量菌落，因此可以認為該試樣對2種菌的抗菌效果較好。當二者質量比為80/20時，從圖2(c)、(f)中可以看出試樣周圍開始出現(xiàn)抑菌圈，且試樣下方沒有細菌繁殖，對2種菌的抗菌效果好。繼續(xù)增加TP含量，發(fā)現(xiàn)除抑菌圈寬度稍有增加外，其余效果與圖2(c)、(f)相似。

表1示出不同質量比PLA/TP復合納米纖維膜抑菌寬度，從表可以看出，隨著復合薄膜中TP含量的增加，抑菌圈寬度也逐漸增加，抗菌效果增強。當PLA與 TP的質量比為 50/50時，對E.coli和S.aureus的抑菌圈寬度分別達到5.17 cm和5.67 cm。并且對S.aureus的抑菌圈寬度要稍大于大腸桿菌的抑菌圈寬度，說明復合薄膜對S.aureus的抗菌效果強于E.coli。

表1 不同質量比PLA/TP復合納米纖維膜抑菌寬度Tab.1 W idths of inhibition zones of PLA/TP com posed membranesw ith differentmass ratios cm

2.3 振蕩燒瓶法分析

圖2 不同質量比PLA/TP復合納米纖維膜抑菌圈實驗效果Fig.2 Results of inhibition zone tests of PLA/TP composed membranes with differentmass ratios

表2示出不同質量HPLA/TP復合納米纖維膜抑菌率。從表可看出，隨著PLA與TP質量比從100/0減小到90/10時，抑菌率明顯提高。對E.coli和S.aureus的抑菌率分別從20.6%和21.3%迅速上升到92.9%和85.7%，當PLA與TP質量比繼續(xù)減小到50/50時，復合納米纖維膜的抑菌率上升趨勢逐漸變緩，對E.coli和S.aureus的抑菌率分別達到96.9%和97.6%。說明不加TP的PLA納米纖維膜的抗菌效果不明顯。當PLA與TP質量比為90/10時，復合納米纖維膜的抗菌性能已得到顯著提高，若再增加TP含量，對抗菌性能的改善已不太明顯。各試樣對S.aureus的抑菌率要稍大于E.coli的抑菌率，與抑菌圈實驗結果一致。

圖3示出不同質量HPLA/TP復合納米纖維抗菌效果。從圖可看出，加了PLA/TP復合納米纖維膜后，平皿中的菌落數(shù)較之不加試樣的有明顯減少，隨著TP含量的增加，菌落數(shù)迅速減少，當PLA與TP質量比從70/30減小到50/50時，從拍攝的圖片中憑肉眼均已很難觀察到菌落。

2.4 復合膜的形貌分析

圖3 不同質量比PLA/TP復合納米纖維膜抗菌效果Fig.3 Antibacterial results of PLA/TP composed membranes with differentmass ratios

表2 不同質量比PLA/TP復合納米纖維膜抑菌率Tab.2 Antibacterial rate of PLA/TP com posed film s w ith differentmass ratios %

為了進一步探討PLA/TP復合納米纖維膜的抑菌機理，采用透射電鏡分析處理前后S.aureus和E.coli超微結構的變化。圖4示出不同薄膜處理前后菌體的TEM照片。從圖中可以看出未經纖維膜處理的S.aureus和E.coli，呈清晰的球狀結構和桿狀結構，菌體細胞壁和細胞膜連續(xù)完整，表面平滑，細胞結構完整，沒有損傷(圖4(a)、(d))。2種菌經PLA納米纖維膜處理后，雖然細胞結構開始模糊，但細胞壁、膜沒有損傷(圖4(b)、(e))。明顯觀察到經PLA/TP(50/50)復合納米纖維膜處理后，細胞質膜開始破裂(圖4(c)、(f))，并且發(fā)現(xiàn)經處理過后的S.aureus細胞膜破裂程度嚴重，導致細胞內容物外泄，見圖4(c)。由此可以推斷PLA/TP復合納米纖維膜破壞了2種菌體細胞膜結構的完整性，內容物呈絮狀流出，細胞質成碎渣樣或呈彌散狀，最終導致細胞死亡。同時可以看出添加TP的復合納米薄膜對S.aureus細胞膜的破壞作用要強于E.coli，作用相同時間后，TEM照片顯示E.coli的細胞膜開始出現(xiàn)大量裂痕，而S.aureus的細胞膜已基本完全破裂，內容物流出。因此在相同作用時間內，PLA/TP復合納米纖維薄膜對S.aureus的抗菌效果要優(yōu)于E.coli。

圖4 不同薄膜處理前后菌體的TEM照片F(xiàn)ig.4 TEM images of bacterial before and after treated by differentmembranes.(a)，(b)，(c):S.aureus before and after treated by PLA membrane and PLA/TP composed membranes;(d)，(e)，(f):E.coli before and after treated by PLA membrane and PLA/TP composed membrane

3 結論

1)FT－IR分析確定聚乳酸/茶多酚復合納米纖維膜中有茶多酚的存在。二者通過價鍵的結合很好地復合在一起。

2)PLA/TP復合納米纖維膜抗菌測試結果均表明:未添加TP的PLA納米纖維膜基本沒有抗菌效果，但隨著TP含量的增加，抗菌性能提高。并且復合納米纖維膜對金黃色葡萄球菌的抗菌效果要優(yōu)于大腸桿菌。抑菌圈實驗結果表明:隨著復合薄膜中TP含量的增加，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌寬度分別從3.67和3.71 cm增加到5.17和5.67 cm。振蕩燒瓶實驗結果表明:少量TP的加入，可使得PLA/TP復合納米纖維膜的抗菌性能得到顯著提高，若持續(xù)增加TP含量，對抗菌性能的改善不太明顯。

3)TEM照片從微觀上揭示了PLA/TP復合納米纖維膜對2種菌種細胞膜結構的破壞作用。同時也揭示了該復合納米纖維薄膜對金黃色葡萄球菌膜結構完整性的破壞作用要強于大腸桿菌。

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