南海陸坡沉積物細菌豐度預測

李 濤，王 鵬

(1.同濟大學海洋地質國家重點實驗室，上海 200092;2.廣州海洋地質調查局，廣州 510760)

自然界中存在的微生物可能多達上百萬種［1］，然而，它們中的大多數沒有被觀測到甚至沒有被檢出，這些微生物的存在只能根據預測來推斷;不過，這種預測也僅僅是基于猜測，以目前的技術還無法完全檢測出微生物多樣性(本文僅討論微生物種數或豐度)全貌。基于非培養的rRNA技術是研究環境微生物多樣性最有效的工具［2］，16S rRNA克隆文庫相比其他研究手段能更多地揭示群落多樣性信息，基于16S rRNA克隆文庫對微生物豐度的預測更能趨近于客觀真實，在土壤、水體、潮間帶等環境中的細菌豐度的估計得到了廣泛應用［3］。

從已發表的文獻來看，常用于預測物種豐度的方法主要有兩大類:參數模型法和非參數估計法。共有5種參數模型:逆高斯分布、對數正態分布、負二項式分布、雙參數(形狀+標尺)帕雷托分布、雙指數分布等，Hong等基于Maple軟件開發出相應的計算程序［3］，供研究使用。基于豐度覆蓋估計法(ACE)以及適用于高異質種群的ACE-1法是兩種用得較多的非參數估計法，基于此算法，Chao等開發SPADE(Species Prediction And Diversity Estimation)軟件［4］免費下載使用。

為防止估計模型的選擇不當對估計值可靠性的影響，本文綜合使用了以上參數模型法和非參數估計法共7種方法對來自南海陸坡的一沉積物柱中的細菌豐度進行估算，并通過比較各種方法與觀測數據的吻合程度，找到最佳估計。此外，由于單一樣品16S rRNA基因文庫規模較小，不能全面反映細菌的多樣性，本文從該沉積物柱不同深度采集12個微生物樣品來構建細菌16S rRNA基因文庫。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2005年5月15日—6月8日IMAGES147航次獲得的深海沉積物柱MD05-2896，采樣點位于南海陸坡區的南沙珊瑚礁臺地西部邊緣(08°49.50'N，111°26.47'E，水深1 657 m)。采用無擾動箱式采泥器采集沉積物柱，總長11 m，從表層到底層以1 m等間距采樣，共12個微生物樣品，船上于 -20℃ 下保存，運回實驗室后儲存于-80℃。

1.2 PCR擴增、RFLP分析與系統發育樹的構建

12個微生物樣品各稱取5 g，采用Zhou抽提法［5］分別提取總DNA，使用細菌16S rRNA通用引物Eubac 27F和Eubac 1492R進行PCR擴增［6］。PCR擴增得到的片斷經純化后克隆到pMD-18T(TaKaRa)載體上，并轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑取陽性轉化子，利用PCR擴增引物重新擴增插入片斷。使用內切酶MspⅠ(Fermentas)切割，分析電泳帶型，挑選不同帶型克隆子測序，并統計不同帶型的克隆子數，將序列提交到RDPⅡ(ribosomal database project)數據庫，利用CHECK-CHIMERA檢驗，去除不合理序列。應用BLASTN程序(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)搜索相似性序列，采用ClustalX(Version 1.8)進行比對分析，通過PAUP(Version 4.0b10)［7］構建系統發育樹，使用Neighbor-Joining建樹方法，選擇Jukes-Cantor進化距離。細菌16SrRNA基因序列在 Genbank核苷酸數據庫中的接受號為 EU048662—EU048694和EU385666—EU385826。

1.3 參數模型的建立

利用CLUSTUALW軟件對沉積物柱MD05-2896細菌16S rRNA序列進行序列比對分析，計算序列相似性，以99%、98%、97%、95%、90%和80%的序列一致性作為分界標準，根據 OS clustering程序的算法(http://www.compbio.dundee.ac.uk/Software/OC/oc.html)，利用無加權組群方法對序列進行聚類分析，將群組定義為“分類單元”(OTU)，計算每個分類單元中的出現次數，即分類單元中的16S rRNA序列數。將分類單元出現次數依次從小到大排列，統計出現次數相同的分類單元個數。以分類單元出現次數和對應的分類單元個數的頻次作為進一步分析的基礎數據。

參數模型通過對樣品數據進行擬合，構建相應的物種豐度分布模型，預測群落中未觀測到的物種數據［8］。首先區分統計意義上“豐富的”和“稀有的”分類單元。選取一個適當的右截點(τ)，當分類單元出現次數＞τ時，則為“豐富的”;當分類單元出現次數＜τ時，則為“稀有的”。然后利用文獻［3］提供的5種參數模型方法進行估計。通過比較不同的估計方法，得出最合理的估計值。選取的標準有:(1)擬合優度(GOF)檢驗:自然擬合優度(na?ve GOF)和漸進擬合優度;(2)能得到有生物學意義的標準差;(3)使用物種頻率觀測數據的最大限度值(即最大的右截點)。

無參數估計法采用“標記釋放回捕法”(MRR)［9］，認為被再次觀測到的物種(“回捕”)與僅觀測到一次的物種能達到均衡，即在多樣性高的群落中，物種被再次觀測到的幾率較小，數量豐富的物種僅能被觀測到一次;相反在一個多樣性很低的群落，數量豐富的物種被再次觀測到的幾率則較高。該類方法基于“豐富的”物種和“稀少的”的物種的相對豐度，來建立估算公式，并利用標準差檢驗。本文利用SPADE軟件［4］中提供的2種方法對細菌豐度進行估計。

由于非參數模型估計一般會低估微生物多樣性;因此，本文主要討論參數模型對細菌豐度的估計。

2 結果

2.1 16S rRNA基因文庫細菌多樣性

以97%序列相似性作為代表型的分界標準，1 329條細菌16S rRNA基因序列分別屬于190個系統發育型，系統發育分析結果表明這些系統發育型主要來自17個已知的類群(“門”):浮霉狀菌(Planctomycetes)、變形桿菌(Proteobacteria)、綠屈撓桿菌(ChloroFlexi)、放線菌(Actinobacteria)、螺旋體(Spirochaetes)、疣微菌(Verrucomicrobia)、酸桿菌(Acidobacteria)、擬桿菌(Bacteriodetes)、鐵還原桿菌(Defferribacteres)、硝化螺菌(Nitrospirae)以及 candidate division OP1、OP3、OP8、OP11、JS1、WS3、TM6。細菌16S rRNA 基因克隆子數和代表型數在細菌“門”中的分布見表1。

2.2 利用模型預測的結果

以99%、98%、97%、95%、90%、80%序列相似性作為分類單元的分界，利用無加權組群方法對1 329條細菌16S rRNA基因序列進行聚類分析，分別組群成212、194、190、168、115、和50個分類單元。利用參數模型來估算分類單元豐度值，結果見表2。

從結果來看(表2)，參數模型得到的預測值一般高于非參數估計法，應從參數模型中尋找最佳估計。Hong等認為應優先考慮與觀測數據擬合程度最好的模型，如果存在多個模型與觀測數據的擬合程度都較好，則比較他們的標準差［3］，得到最優模型，本文也依此尋找最佳估計。從本研究數據來看，出現次數較少(＜5次)，尤其出現次數為1次的分類單元個數最多，它們是群落的主體;模型擬合的結果是否與觀測數據吻合，關鍵是出現次數小于5次的分類單元個數的預測值是否接近觀測值。結果表明當分類單元分界為99%和

90%序列一致性時，雙指數分布為最佳估計模型，估計值分別為326±40(SE)和127±4(SE);當分類單元分界為98%和80%序列一致性時，帕雷托分布為最佳估計模型，估計值分別為251±9(SE)和62±4(SE);當分類單元分界為97%和95%序列一致性時，負二項式分布為最佳估計模型，估計值分別為244±10(SE)和220±6(SE)。圖1顯示了以99%、97%、90%和80%序列一致性為分類單元分界標準，最優分布模型估計的分類單元出現次數及對應的分類單元個數與實際數據的擬合情況。從圖上看，分類單元個數預測與實際值較吻合，尤其是出現次數較少的分類單元個數的預測與實際數據基本一致，選取的模型符合對細菌豐度的估計。

表1 沉積物柱MD05-2896克隆子在細菌“門”中的分布Table 1 Bacterial phyla detected among sequenced clones in sediment core MD05-2896

表2 沉積物柱MD05-2896中細菌的豐度Table 2 Bacterial richness of the core MD05-2896

續表

圖1 細菌克隆子庫中的分類單元頻率分布及參數模型擬合Fig.1 Frequency distribution of OTUs in the bacterial library versus parametric model's fitted values

目前，利用16S rRNA基因序列對細菌“種”的劃分還存在較大爭議，1%和3%的序列差異都被用于“種”的定義，較合理的辦法是以1%序列差異作為菌株分類標準，以3%作為“種”的分類標準［3］，在此標準下，估計約326±40(SE)個菌株，244±10(SE)個種。

細菌的“屬”、“科”/“綱”和“門”等分類單元很難通過16S rRNA基因序列的差異來準確劃分，已有文獻分別將5%、10%和20%的序列差異作為以上各分類單元的界限［10-12］。依此推斷沉積物柱MD05-2896中細菌群落大約包括62±4(SE)個“門”，127±4(SE)個“科”/“綱”和220±6(SE)個“屬”。

發射臺架控制系統雙機冗余熱備份控制技術研究……………………………………………… 李博，趙慧莉（4-255）

3 討論

3.1 細菌豐度估計的可靠性

從已發表的文獻來看，來自不同環境的樣品，對細菌豐度的估計值相差很大，如耕地或重金屬污染的土壤中細菌豐度估計值為300—1 500［8，13］;而未開發土壤中的細菌豐度的估計值則高達6 000—10 000［14］，甚至達到500 000［15］。16S rRNA基因技術從環境樣品中檢出的細菌一般只有幾十種，最多不過幾百種，不同環境中細菌豐度是否有如此大的差別?Hong等認為環境中細菌豐度不應有如此大的差別，這些估計值并不可靠，原因在于研究者選擇了錯誤的模型［3］，但該觀點并未獲得證實。

為進一步探討細菌豐度估計值的可靠性，本文與Hong等的研究結果進行了比較。本文與Hong等的基礎數據都來自16S rRNA基因文庫，并采用了完全相同的估計模型，但得到細菌“種”數的估計值卻相差很大。造成差異的原因可能與樣品本身或構建的文庫質量等因素有關。

從估計的結果來看，本文對細菌“種”數的估計值與觀測值相差不大，都為102量級，而且對采自西沙海槽的沉積物柱MD05-2902中的細菌豐度預測值為179±9(SE)，也只達到102量級;然而，Hong等細菌物種數量的估計值約為觀測值的10倍左右，為103量級［3］。利用分布模型估計細菌豐度的原理是利用分類單元出現次數的頻率分布對觀測值擬合，得出各參數值，進而估計未檢出分類單元個數。在頻率分布曲線上表現為:曲線左端越陡，利用模型預測次數為0(未檢出)的分類單元個數則越多，預測值與觀測值差別越大。Hong樣品的細菌克隆文庫中絕大多數分類單元出現次數只有1，即樣品中絕大多數分類單元被再次觀測到的幾率小，出現次數為1的分類單元個數遠大于出現次數為2(被再次觀測)的分類單元個數，頻率分布曲線左端很陡，表明樣品中存在大量未檢測出的分類單元，估計值就遠大于觀測值。本文研究樣品的細菌克隆文庫有較多的分類單元出現次數大于1，頻率分布曲線左端相對較緩(圖1);利用分布曲線預測未檢出的分類單元個數較少，即分類單元被再次觀測到的幾率很高，遺漏的分類單元數量則較少，因而估計值接近觀測值。

3.2 細菌豐度估計的影響因素

影響細菌豐度估計值可靠性的因素主要有兩個:首先是估計模型的選擇，不同的估計模型得到的結果可能有較大的差異;其次是用于估計的基礎數據，而這種基礎數據是通過實驗手段來獲取的，數據質量主要取決于對實驗技術的評價。

3.2.1 估計方法

目前，對參數模型和非參數估計法孰優孰劣存在較大的爭議［9］，即便只使用參數模型，存在如何選擇模型的困惑。

對參數模型而言，很難建立一個足夠大的微生物多樣性數據庫來支持模型的使用和對各模型中的分布參數進行賦值。因為沒有經驗值，只能通過理論上來推斷最佳模型。但不同的學者對最佳模型的選取標準完全不同。Curtis等認為細菌群落具有高動態性，增長隨意，群落分布符合對數正態分布［14］;不過Jeon指出當出現次數為1的分類單元占很高比例時，逆高斯分布模型對微生物豐度有較好的估計［16］;Hong等認為并不存在一個普遍適用的模型［3］，只能通過綜合利用各種模型來以增加估計的可靠性。

非參數估計法完全依賴于分類單元相對豐度的估計，在調查微生物多樣性的過程中難免出現取樣偏差;此外，非參數估計法提供的是一個更小范圍的分類單元多樣性，即只從觀察到的分類單元中獲取信息，與參數模型不同，非參數估計法不能給出分類單元相對豐度的假想分布，容易忽略了那些“稀少的”分類單元，導致對微生物豐度的低估。

3.2.2 實驗技術

就實驗本身而言，任何實驗都無法檢測自然界中的全部微生物。基于16S rRNA基因的PCR-RFLP方法也不例外，同樣會造成對生物多樣性的低估，該技術影響微生物多樣性低估的主要因素是克隆文庫的規模和實驗偏差。

圖2 細菌16S rRNA基因克隆文庫稀疏曲線Fig.2 Rarefaction curves of bacterial 16S rRNA gene library從上到下依次為:8m，7m，4m，6m，2m，11m，3m，surface，1m，9m，10m和5m

(1)克隆文庫的規模

克隆文庫并非越大越好，因為哪怕構建最大的克隆文庫，也不能窮盡所有的微生物。不過，如果克隆文庫選取過小，則會喪失部分物種多樣性信息。文庫要達到何種規模，才能滿足完全反映多樣性的要求?稀疏分

析［13］以及克隆文庫的覆蓋度 C值［17］能提供判斷依據。使用Analytic Rarefaction軟件對本文研究的12個樣品分別繪制16S rRNA基因克隆文庫稀疏曲線(圖2)，從圖上可以看出，所有稀疏曲線在克隆子數達到100后趨于平緩，部分達到平臺期。從表層往下，C值分別為

89%、90%、93%、92%、79%、92%、87%、79%、85%、97%、77%和83%，這些樣品的克隆文庫的C值多數在90%左右或大于90%以上。綜合稀疏分析和覆蓋度計算結果，細菌16S rRNA基因克隆文庫能大致反映微生物多樣性。

(2)實驗偏差

實驗過程中的偏差主要表現在總DNA的損耗、PCR擴增效率以及PCR偏嗜性。

環境樣品總DNA的提取，無論是物理裂解，化學裂解，還是生物裂解，在提取過程中都會引起DNA的損耗。如物理裂解造成長片斷DNA的物理剪切;化學裂解法不能完全去除腐殖酸、色素和重金屬等雜質;抽提后殘余的苯酚等會影響PCR的擴增效率［18］。

PCR的偏嗜性主要表現在:(1)PCR擴增過程中，模板濃度過低會引起模板的隨機擴增［18］，高GC含量的模板比低GC含量的模板擴增效率低［19］，低GC含量模板更易于擴增，結果擴增產物中低GC含量DNA偏多。(2)目前通用的16S rRNA基因引物擴增范圍并不能完全覆蓋所有目標類群［18］，尤其是針對深海環境中的微生物，據Webster等的估計，27F和1492R引物分別覆蓋自然界中全部細菌的72.9%和16.3%［18］;不過，Webster的觀點可能過于保守，目前還很難找到替代的通用引物，更別說針對深海環境的通用引物。

雖然基于16S rRNA基因的PCR-RFLP方法會低估環境中微生物多樣性，但卻是目前最成熟的方法，對微生物豐度的預測也多基于由該方法所獲取的多樣性數據。隨著技術的發展，16Sr DNA-DGGE(變性凝膠電泳)、宏基因組文庫中的數據也將逐漸用于估計環境樣品中微生物的豐度，對PCR-RFLP方法進行進一步的驗證。

總之，本文對南海陸坡沉積物柱細菌豐度進行最優估計估計，以97%序列一致性作為“種”的劃分標準，負二項式分布模型最優，估計細菌的種數為244±10(SE)，鑒于16S rRNA基因的PCR-RFLP實驗技術會低估細菌的多樣性，該值可能偏低。

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