多西紫杉醇對大腸癌細胞放射增敏的作用研究

趙維勇 劉志遠 畢良文 張麗珍▲

1.南京醫科大學第二附屬醫院放療科，江蘇南京 210011；2.南京市胸科醫院放療科，江蘇南京 210011

在消化系統惡性腫瘤中，大腸癌最為常見。 大腸癌患者的發病率及死亡率每年均呈增長趨勢，如今在我國，大腸癌已成為惡性腫瘤病死原因的第2 位。大腸癌確診時大多已為晚期，術前放射治療可以使腫瘤體積縮小，從而能降低直腸癌的臨床分期及局部復發率，最終達到延長生存期的目的。 近年來，放療聯合化療藥物使直腸癌療效提高，患者受益，因而在局部晚期直腸癌中，新輔助治療多選擇放化療聯合[1]。 多項研究已證實多西紫杉醇能提高非小細胞肺癌、宮頸癌、食管癌等細胞的放射敏感性[2-4]。本實驗以多西紫衫醇聯合放療作用于大腸癌細胞，探討多西紫衫醇對腸癌潛在可能的放射增敏作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 人腸癌細胞株SW480 細胞購自上海生命科學研究院；多西紫杉醇（艾素）為江蘇恒瑞醫藥股份有限公司生產；RMI-1640 購自GIBCO BRL 公司；AnnexinV-FITC/PI 檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司。

1.1.2 主要儀器 生物倒置顯微鏡，CO2培養箱， 分光光度計，醫科達醫用直線加速器（瑞典），臺式低速離心機，流式細胞儀。

1.2 方法

1.2.1 MTT 法觀察多西紫杉醇對SW480 的增殖抑制作用 設對照組、空白組及多西紫杉醇作用組。SW480細胞培養到一定數量，96 孔細胞培養板中每孔約5×103個細胞。 加入不同濃度多西紫杉醇（0.1、0.5、1、3、5、10、20、40、60 μg/mL）培養液，每個濃度及組內設3 復孔。 繼續培養24、48、72 h 后，將96 孔板進行MTT 染色，測定OD 值（λ=490 nm），計算抑制率。 抑制率（%）＝（1-實驗組OD 值/對照組OD 值）×100%。 以抑制率為縱軸，多西紫杉醇濃度為橫軸，制作SW480 細胞生長抑制曲線圖。 通過概率單位加權回歸法（Bliss 法）計算IC50。

1.2.2 克隆形成法檢測多西紫杉醇對直腸癌SW480細胞的放射增敏作用 完全培養液3 mL 于5%CO2，37℃培養箱中培養24 h，細胞貼壁后，進行分組處理：對照組；多西紫杉醇組：多西紫杉醇5 μg/mL（20% IC50）；放療組：不同照射劑量（0、1、2、4、6、8 Gy） 照射；多西紫杉醇+放療組：5 μg/mL 多西紫杉醇處理細胞后2 h，再分別進行不同劑量（0、1、2、4、6、8 Gy）照射。每個濃度及組內設3 復孔。 處理結束后繼續培養48 h，然后棄去含藥物的培養液， 換新鮮的不含藥物的培養液，于培養箱內培養10～14 d。 當6 孔細胞培養板中出現肉眼可見的克隆的時候，經過洗滌、固定、染色，在低倍鏡下計數大于50 個細胞的克隆數，計算相關指標。公式：貼壁率（plating efficiency，PE）=對照組每孔克隆數/每孔細胞種植數×100%； 存活率或存活分數（surviving fraction，SF）=實驗組每孔克隆數/（每孔種植數×貼壁率）。以單擊多靶數學模型擬合細胞存活曲線，計算出放療組和放療聯合藥物組的D0值， 放射增敏效應以放射增敏比（SERD0）表示，定義為單獨放療組與放療聯合藥物組的D0之比。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞周期分布 分組： 對照組、放療組、多西紫杉醇組和多西紫杉醇+放療組。將細胞接種于6 孔板中，待細胞貼壁后，對照組更換無藥培養液，多西紫杉醇組更換含有5 μg/mL 多西紫杉醇的培養液，放療組給以4 Gy 劑量照射；多西紫杉醇+放療組給予5 μg/mL 多西紫杉醇同時接受4 Gy 照射。組內設3 復孔。繼續培養48 h，收集細胞，洗滌、固定、PI 染色后，記錄激發波長488 nm 處紅色熒光。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI 染色法檢測細胞凋亡實驗分四組：對照組、單純照射組、多西紫杉醇組和多西紫杉醇+放療組。待細胞貼壁后，加入相應的含藥培養基及照射處理（同“1.2.3”項下），每個濃度及組內設3 復孔。 藥物作用48 h 后， 收集細胞、 洗滌， 加入Annexin V-FITC、Propidium Iodide， 采用流式細胞儀觀察細胞凋亡的發生情況

1.3 統計學方法

采用SPSS 16.0 統計學軟件進行數據分析， 計量資料數據用均數±標準差（s）表示，多組間比較采用單因素方差分析， 組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 多西紫杉醇對SW480 細胞增殖的影響

多西紫杉醇抑制SW480 細胞增殖作用與濃度呈正相關（F = 84.71，P ＜0.001）；與時間呈正相關（F = 26.30，P ＜0.001）。 見表1、圖1。 后續研究選擇多西紫杉醇5 μg/mL 作用48 h， 作為放射增敏濃度和時間。

表1 多西紫杉醇對人腸癌細胞SW480 增殖的抑制作用（%，s）

表1 多西紫杉醇對人腸癌細胞SW480 增殖的抑制作用（%，s）

0.1 0.5 1351 0 20 40 60 1.11±2.43 2.34±1.56 8.30±1.54 10.30±1.39 21.33±1.23 28.44±0.99 34.21±1.43 40.34±1.23 45.22±1.51 1.33±2.01 3.89±2.18 10.22±1.19 13.45±1.29 23.92±2.20 38.65±1.23 49.67±1.00 54.76±1.18 57.33±1.35 3.11±2.39 8.22±2.30 17.33±1.23 22.13±1.76 35.33±2.01 44.11±1.24 56.33±1.02 61.21±1.10 63.11±1.94

圖1 多西紫杉醇對人腸腺癌細胞SW480 增殖的抑制作用

2.2 多西紫杉醇的放射增敏實驗結果

由表2 可見，SF 及克隆形成隨著照射劑量的升高而降低。 使用單擊多靶模型對SF 和放射劑量進行曲線擬合，見圖2。 根據擬合的細胞存活曲線及相關公式，得出相應參數D0、Dq、SER 值，多西紫杉醇+放射組的Dq、SF2值均低于單純放療組，見表3，提示多西紫杉醇可使SW480 細胞的放射敏感性明顯增強，其SER 值為1.73。

2.3 多西紫杉醇影響SW480 細胞周期的分布

流式細胞儀結果顯示， 多西紫杉醇作用后，SW480 細胞周期發生變化，G2/M 期細胞比例由（32.19±0.47）%增高到（46.24±0.07）%，多西紫杉醇+放療組增高到（58.08±0.05）%，差異有統計學意義（P＜0.05）。 見表4、圖3。

表2 多西紫杉醇、多西紫杉醇聯合放射線的細胞存活分數

圖2 根據單擊多靶模型擬合細胞存活曲線

表3 不同組別細胞存活曲線的主要參數

表4 多西紫杉醇聯合或不聯合放療對人腸癌SW480 細胞周期的影響（%，s）

表4 多西紫杉醇聯合或不聯合放療對人腸癌SW480 細胞周期的影響（%，s）

注：與對照組比較，#P < 0.05；與放療組比較，*P < 0.05

對照組多西紫杉醇組放療組多西紫杉醇+放療組38.29±0.85 32.42±0.28 28.91±0.27 23.63±0.32 29.52±0.51 21.34±0.58 21.72±0.46 18.29±0.45 32.19±0.47 46.24±0.07#49.37±0.35#58.08±0.05#*

圖3 多西紫杉醇聯合或不聯合放療對人腸癌SW480 細胞周期的影響

2.4 Annexin V-FITC/PI 染色法檢測多西紫杉醇聯合放療對人腸癌細胞SW480 凋亡的影響

流式細胞儀檢測各組細胞經不同處理后的細胞凋亡的改變，結果顯示，多西紫杉醇可提高放療誘導的凋亡（P < 0.05）。 見表5。

表5 多西紫杉醇不聯合或聯合放射線對人腸癌細胞SW480 凋亡的影響（%，s）

表5 多西紫杉醇不聯合或聯合放射線對人腸癌細胞SW480 凋亡的影響（%，s）

注：與對照組比較，#P < 0.05；與放療組比較，*P < 0.05

對照組多西紫杉醇組放療組多西紫杉醇+放療組1.43±0.05 18.33±0.32#8.98±0.03#21.54±0.22#*

3 討論

直腸癌常使用放療作為局部治療方法，在直腸癌的綜合治療中，放療扮演著重要角色。但臨床上，直腸癌患者對放射治療的敏感性表現各異，可能是因為腫瘤細胞乏氧的程度有差異， 同時腫瘤本身存在異質性，并且直腸癌放療可以引起消化道出血、疼痛、穿孔等放療反應， 尤其是在超過正常組織耐受劑量情況下，反應更為強烈，患者難以耐受。高效低毒的放射增敏劑可提高直腸癌放療效果， 提高患者生活質量，成為腫瘤放射治療的研究熱點[1]。

多西紫杉醇是一種半合成的紫杉醇類抗腫瘤新藥，作用于細胞的微管系統，在腫瘤細胞有絲分裂時，能促進微管聚合，同時抑制微管解聚，使游離微管減少，影響細胞有絲分裂的進行，引起腫瘤細胞死亡。多項研究證實，多西紫杉醇對頭頸部惡性腫瘤、卵巢癌、非小細胞肺癌和乳腺癌等多種細胞株都有抑制增殖的作用，同時腫瘤細胞的凋亡增加。深入研究發現，多西紫杉醇可引起細胞bcl-2 基因磷酸化而失活，同時bax基因過度表達，從而誘導了腫瘤細胞凋亡增加[5-6]。 另外，大量的動物實驗及臨床研究證實，多西紫杉醇能提高宮頸癌、非小細胞肺癌、乳腺癌等細胞的放射敏感性[2-3]。 本研究表明， 多西紫杉醇對大腸癌細胞系SW480 有類似作用， 多西紫杉醇對大腸癌細胞系SW480 的生長抑制作用有一定的劑量和時間依賴性；多西紫杉醇+放療組的D0、Dq、SF2值均比單純照射組低，5 μg/mL 多西紫杉醇SER 值為1.73；SW480 細胞經多西紫杉醇處理后對射線更敏感，細胞凋亡增加，多西紫杉醇+放療組凋亡發生率為（21.54±0.22）%，明顯高于單獨放療組。本研究顯示多西紫杉醇對大腸癌細胞系SW480 有放射增敏作用， 說明多西紫杉醇對SW480 細胞是一種良好的放射增敏劑。

細胞對放射線的敏感性與所處的細胞周期時相相關，G2/M 期最敏感，S 期對放射抗拒[7]。 不同化療藥物作用機制和環節不同，大多可改變細胞周期。 有目的使用化療藥物，從而改變細胞周期，可增加放射敏感性，對腫瘤治療有重要意義。有研究表明，多西紫杉醇具有放射增敏作用，表現為腫瘤細胞G2/M 期阻滯，同時乏氧細胞再氧合，從而對射線敏感性增加[2]。本研究發現，多西紫杉醇可以使SW480 細胞的G2/M 期比例升高（46.24±0.07）%比（32.19±0.47）%，多西紫杉醇+放療組更高達（58.08±0.05）%，S 期比例降低。 提示多西紫杉醇使細胞周期重新分布， 各期比例變化，G2/M 期腸癌細胞比例增加， 放療后細胞凋亡明顯增加。

綜上所述，本實驗顯示，多西紫杉醇對大腸癌細胞具放射增敏作用，其機制可能是改變了腸癌細胞的周期分布，誘導其凋亡增加。 本實驗探索為直腸癌的治療提供了新的手段和方法，但其分子機制及臨床使用的時機、劑量和策略仍需進一步探索和深入研究。

[1] Nilsson PJ，van Etten B，Hospers GA，et al.Short-course radiotherapy followed by neo-adjuvant chemotherapy in locally advanced rectal cancer-the RAPIDO trial[J].BMC Cancer，2013，13：279.

[2] Tabuchi S，Ozawa S，Koyanagi K，et al. Radiation-sensitizing effect of low-concentration docetaxel on human esophageal squamous cell carcinoma cell lines [J]. Exp Ther Med，2011，2（4）：601-606.

[3] Chen Y，Pandya KJ，Hyrien O，et al.Preclinical and pilot clinical studies of docetaxel chemoradiation for Stage Ⅲnon-smallcell lung cancer[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys，2011，80（5）：1358-1364.

[4] Xia S，Yu S，Fu Q，et al. Inhibiting PI3K/Akt pathway increases DNA damage of cervical carcinoma Hela cells by drug radiosensitization [J]. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2010，30（3）：360-364.

[5] Pereira MC，de Bessa-Garcia SA，Burikhanov R，et al. Prostate apoptosis response-4 is involved in the apoptosis response to docetaxel in MCF-7 breast cancer cells [J]. Int J Oncol，2013，43（2）：531-538.

[6] Manandhar S，Choi BH，Jung KA，et al. NRF2 inhibition represses ErbB2 signaling in ovarian carcinoma cells：implications for tumor growth retardation and docetaxel sensitivity [J].Free Radic Biol Med，2012，52（9）：1773-1785.

[7] Milanovi D，Firat E，Grosu AL，et al. Increased radiosensitivity and radiothermosensitivity of human pancreatic MIA PaCa-2 and U251 glioblastoma cell lines treated with the novel Hsp90 inhibitor NVP-HSP990 [J]. Radiat Oncol，2013，8：42.