生姜提取物對阿爾茨海默病大鼠動物模型的氧化應激因子的影響

曾高峰 ，張志勇，魯 力，肖德強，宗少暉，何建明

1廣西醫科大學公共衛生學院;2 廣西醫科大學第一附屬醫院脊柱骨病外科;3 廣西醫科大學研究生學院，南寧530021

據統計，我國約有1.6 億老年人，人口老齡化是目前較嚴峻的社會公共問題。同時也使得醫療行業面對諸多老年疾病，其中，怎樣攻克老年癡呆是急需解決的問題之一。本研究通過觀察生姜提取物對AD 大鼠氧化應激指標SOD、CAT 及MDA 水平的影響，探討其對AD 的治療作用及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級健康SD 大鼠(雌雄各半)60 只，體重210～280 g，平均240 ± 16.7 g。購于廣西醫科大學動物實驗中心，本實驗研究符合廣西醫科大學動物保護委員會標準要求，實驗中盡可能減少動物使用數量和減輕動物痛苦。動物予適應性喂養1 周。

1.2 試劑

生姜提取物:含量為5%姜辣素［6-姜辣醇(6-Gingerol)、6-生姜酚(6-Shogaol)、8-姜辣醇(8-Gingerol)、10-姜辣醇(10-Gingerol)］，其中6-姜辣醇(6-Gingerol)為主要成分。由上海靈菱食用菌科技有限公司提供。

β 淀粉樣蛋白:Aβ25-35(批號:050M4764)250 μg(美國Sigma 公司)加入無菌生理鹽水，制成1 g/L 的溶液，保持在37 ℃恒溫箱孵育3 d，使其老化并成為聚集態的Aβ25-35。

超氧化物歧化酶(SOD)一抗、過氧化氫酶(CAT)一抗、大鼠丙二醛(MDA)elisa 檢測試劑盒:均由北京博奧森生物技術有限公式提供。

1.3 主要儀器

SR-5R 型腦立體定位儀(日本成茂公司);微量注射器(上海醫用激光儀器廠);MK3 型酶標儀(美國Thermo 公司);光學顯微鏡(XSP-12C，上海永亨光學制造有限公司);病理圖像分析儀(DMR +Q550，德國LEICA 公司)。

1.4 實驗方法

將大鼠用10%水合氯醛(0.5 μL/g)麻醉，固定于腦立體定位儀上，對耳線跟上頜骨三角固定，保持頭蓋骨水平。剪去頭頂部毛發，碘酊消毒并75%酒精脫碘后切開皮膚，參考Paxinos＆Watson 的方法選取大鼠側腦室［1］，于前囟向后0. 8 mm，中線旁開1.4 mm 處，三棱針鉆開顱骨，暴露硬腦膜，再用微量注射器緩慢自腦表面垂直進針3.6 mm，將Aβ25-35緩慢注入5 μL(約10 min)，假手術組側腦室注射等量無菌生理鹽水，留針10 min 后緩慢撤針，撒些許青霉素粉后，縫合切口，并用碘伏消毒切口。單籠單只飼養待全部大鼠完全清醒并恢復活動。

術后應用抗菌素，連續三天肌注青霉素10 萬單位/次，2 次/日和慶大霉素1000 單位/次，2 次/日(廣西醫科大學第一附屬醫院藥劑科提供)。

1.5 氯化鋁灌胃

待全部大鼠完全清醒并恢復活動并術后愈合后，每日予3%氯化鋁100 mg/kg 灌胃。持續30 d。

1.6 用藥階段

生姜低劑量、中劑量、高劑量組分別予劑量為1、2、4 g/kg 生姜醇提取物，每只大鼠每日劑量以生理鹽水兌至5 mL，分兩次灌胃;石杉堿甲組予石杉堿甲片200 μg/kg，磨碎后兌生理鹽水至每只大鼠5 mL，分兩次灌胃;空白對照組每只大鼠予生理鹽水5 mL，分兩次灌胃;假手術組不予處理。灌胃用藥持續28 d。

1.7 組織取材及免疫組織化學染色及檢測IOD

將大鼠用10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉，取血后快速開胸，將針尖磨平的20 mL 注射器針經左心室心尖穿刺達到主動脈插管，并血管鉗夾固定針，以500 mL 冷生理鹽水快速沖洗直至流出澄清液，以4%多聚甲醛400 mL 灌注固定，維持約60 min。待雙上肢硬化后除去顱蓋骨，取出完整的大腦組織，用上述固定液固定24 h 后，取大腦后1/3 海馬區豐富為標本，常規脫水，石蠟包埋，作連續冠狀切片，片厚4～5 μm。常規脫蠟。

采用SP 法免疫組織化學法檢測大鼠大腦中SOD 及CAT 的表達水平。SOD 一抗工作濃度為1∶400，CAT 一抗工作濃度1∶400。光學顯微鏡下觀察染色結果，陽性細胞呈棕褐色或棕黃色。每張切片于400 倍鏡下取10 個不同視野，采用病理圖像分析儀及Leica QWIN 圖像分析軟件相結合分析同期制作的免疫組化切片，并根據圖像的染色情況定下一個統一的標準，據此測定出大鼠大腦中SOD 及CAT 的積分光密度(IOD)值，IOD 值與SOD 及CAT的活性呈正相關，即IOD 值越大，相應的SOD 及CAT 的活性越高，IOD 值越小，相應的指標活性也越低。

1.8 丙二醛(MDA)檢測

大鼠常規心臟取血1.0～2.0 mL，加入到抗凝EB 管中室溫靜置4 h 后以5000 rpm 離心20 min 后取血清，置于-80 ℃冰箱中保存待用。MDA 采用elisa 分析方法，按照說明書步驟操作，數據在取450 nm 酶標儀上于15 min 內讀取，后通過標準品制成的濃度曲線公式計算出MDA 濃度。

1.9 統計學處理

采用SPSS17.0 統計軟件包進行統計分析，各組數據均采用x ± s 表示，采用方差分析(one-way ANOVA 法)，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 大鼠大腦海馬區SOD 及CAT 的表達

400 倍鏡下，生姜高劑量組、石杉堿甲組、較生姜中劑量和低劑量、空白對照組陽性細胞、神經元細胞數目及層數多，神經元細胞排列較整齊，神經元細胞較大，胞質多;細胞核固縮，膠質細胞及神經元纖維纏結少。生姜高劑量組與石杉堿甲組無明顯差別;生姜中劑量、低劑量及空白對照組間無明顯差別。SOD、CAT 積分光密度統計學分析:OP + HG組、OP + HupA 組較OP + LG 組和OP + MG 組、OP 組大腦組織中SOD、CAT 積分光密度明顯增高(P ＜0.05)，生姜高劑量組與石杉堿甲組無明顯差別(P ＞0.05)，生姜中劑量組、低劑量組及空白對照組間無明顯差別(P ＞0.05)。見表2。

2.2 大鼠大腦海馬區MDA 的表達

丙二醛(MDA)elisa 分析表明，生姜高劑量組、石杉堿甲組較生姜中劑量和低劑量、空白對照組血清中MDA 水平明顯升高(P ＜0.05)。見表1。生姜高劑量組與石杉堿甲組無明顯差別(P ＞0.05)，生姜中劑量組、低劑量組及空白對照組間無明顯差別(P ＞0.05)。

表1 MDA 血清濃度(Elisa 分析法)(±s)Table 1 Serum concentrations of MDA (Elisa analysis)(±s)

表1 MDA 血清濃度(Elisa 分析法)(±s)Table 1 Serum concentrations of MDA (Elisa analysis)(±s)

注:a.與OP + LG 組比較，P ＜0.05;b.與OP + MG 組比較，P ＜0.05;c.與OP + HG 組比較，P ＜0.05;d.與SHAM 組比較，P ＜0.05;e.與OP + HupA 組比較，P ＜0.05;f.與OP 組比較，P ＜0.05。Note:a.Compare with OP + LG，P ＜0.05;b.Compare with OP + MG，P ＜0.05;c.Compare with OP + HG，P ＜0.05;d.Compare with SHAM，P＜0.05;e.Compare with OP + HupA，P ＜0.05;f.Compare with OP，P ＜0.05.

組別GroupnMDA(nmol/mL)生姜提取物低劑量組OP + LG104.27 ±2.19cde生姜提取物中劑量組OP + MG104.91 ±2.45cde生姜提取物高劑量組OP + HG103.34 ±1.20abf假手術組SHAM82.25 ±1.12abf石杉堿甲組OP + HupA102.65 ±1.09abf空白對照組OP75.80 ±2.52cde

表2 大鼠大腦中SOD 及CAT 積分光密度(IOD)結果(±s)Table 2 Integral optical density (IOD)of SOD and CAT in rat brain (±s)

表2 大鼠大腦中SOD 及CAT 積分光密度(IOD)結果(±s)Table 2 Integral optical density (IOD)of SOD and CAT in rat brain (±s)

注:a 與OP + LG 組比較，P ＜0.05;b 與OP + MG 組比較，P ＜0.05;c 與OP + HG 組比較，P ＜0.05;d 與SHAM 組比較，P ＜0.05;e 與OP + HupA 組比較，P ＜0.05;f 與OP 組比較，P ＜0.05Note:a.Compare with OP + LG，P ＜0.05;b.Compare with OP + MG，P ＜0.05;c.Compare with OP + HG， P ＜0.05;d.Compare with SHAM，P ＜0.05;e.Compare with OP + HupA，P ＜0.05;f.Compare with OP， P ＜0.05

組別GroupnSOD(IOD)CAT(IOD)生姜提取物低劑量組OP + LG10178.31 ±10.95cde231.86 ±12.44cde生姜提取物中劑量組OP + MG10190.85 ±14.46cde241.31 ±13.49cde生姜提取物高劑量組OP + HG10248.74 ±16.41abf263.73 ±17.18abf假手術組SHAM8262.31 ±18.50abf304.10 ±18.04abf石杉堿甲組OP + HupA10250.99 ±17.11abf291.21 ±18.23abf空白對照組OP7170.22 ±12.12cde218.74 ±14.48cde

3 討論

AD 即老年癡呆癥，是種進行性發展的致死性的神經退行性的疾病。目前臨床上對AD 缺乏有效的治療手段，這是由于AD 不清晰的病因及復雜的發病機制所致［2］。有研究表明，大腦組織的氧化應激反應參與了AD 的發生和發展［3］。因此，對AD治療的研究是擺在醫療工作者面前的一個難題。生姜屬于多年生宿根草本植物。其塊莖中含有多種成分，其中有姜辣素、姜精油、姜酚及黃酮等，還含有多種微量元素［4］。生姜味辛性溫，具有溫中止嘔、解表散寒及抗氧化抗癌等功效［5］。除此之外，生姜還具有很多功能有待我們發現。本研究采用側腦室注射Aβ25-35 及氯化鋁溶液灌胃，觀察其對β-淀粉樣蛋白致AD 大鼠腦組織氧化應激的影響，并進一步探討生姜提取物對AD 的療效及其可能的作用機制，為生姜提取物臨床治療AD 提供一定的實驗依據。

德國醫生Alois Alzheime(1864～1915)于90年前首先對AD 進行描述，90 年里人們對AD 的研究取得了很大的進展，但發病機制至今未明，主要是原因是確切的病因和病理生理過程十分復雜，其主要的病理表現是腦內神經纖維纏結(主要成分是過磷酸化tau 蛋白)和老年斑(主要成分是β 淀粉樣多肽，即Aβ)［6］。Aβ 具有神經毒性作用，能直接引起神經元的死亡和誘導的神經細胞凋亡都已被證實［7］，Aβ 是AD 形成并發展的主要因素。因此本研究以Aβ 和氯化鋁雙干預建立AD 大鼠模型［8］。關于AD 的發病機制，目前比較認可的假說為氧化應激假說、能量代謝假說、amyloid 級聯反應假說以及膽堿能假說等［9］。氧化應激的定義是指氧化物超過了機體內源性的抗氧化能力從而引起機體組織的分子氧化，并造成組織損傷。氧化應激假說能一定程度上解釋AD 病理改變和認知及記憶功能的改變［10］。說明氧化應激是AD 主要病因之一，而氧化應激在一定程度上可以說是貫通于其他幾種假說。

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)能有效地清除體內氧自由基，SOD 及CAT 的活性高低決定了機體清除氧自由基能力的大小。丙二醛(MDA)為多不飽和脂肪酸過氧化物的降解產物，是脂質氧化的終產物，機體內MDA 水平能反應出機體氧化應激的程度。

本研究顯示，生姜提取物干預的OP + HG 組、OP + MG 組、OP + LG 組AD 大鼠大腦SOD、CAT的陽性表達活性較OP 組都有不同程度的升高，MDA 水平下降，但僅OP + HG 組差異性顯著(P ＜0.05)，OP + MG 組、OP + LG 組差異不顯著(P ＞0.05)。

SHAM 組及OP + HupA 組較OP 組SOD、CAT陽性表達明顯升高(P ＞0.05)，MDA 水平明顯降低(P ＞0.05)。在一定程度上說明側腦室穿刺術對本實驗影響較小，也說明了Aβ25-35 干預能較好地建立AD 大鼠模型。

綜上所述，生姜提取物在高劑量時能夠提高AD 大鼠大腦中SOD、CAT 陽性表達，并能降低MDA水平，即生姜提取物能在一定程度上改善阿爾茨海默病(AD)氧化應激反應。但生姜提取物是通過清除氧自由基還是提高相關酶的活性，抑或是兩者都兼備，目前還不明了，其具體的機制仍需進一步研究。

1 Paxinos G，Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates. 4thed. New York:Elsevier Science ＆ Technology Press，2004.

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10 Christen Y. Oxidative stress and Alzheimer disease. Am J Clin Nutr，2000，7l:62l-629.