鴉膽子中苦木內酯類化合物的制備分離和化學表征

周中流 ，黃詩瑤，梁燕君，何妙玲，馮宗財，夏敬民

1湛江師范學院 化學科學與技術學院制藥工程系;2 湛江師范學院 廣東高校新材料工程技術開發中心，湛江524048

鴉膽子為苦木科植物鴉膽子(Brncea Javaniea L.Merr)的灰黑色長圓形或卵形的干燥成熟果實，是民間傳統常用中藥，該藥材原植物主產于我國南方沿海熱帶和亞熱帶地區。文獻報道［1，2］，中藥鴉膽子中主要含有苦木內酯，脂肪酸和生物堿等成分。我國傳統中醫將其用于清熱、燥濕、殺蟲、解毒。據報道，鴉膽子具有抗瘧、抗炎和抗腫瘤等作用［3］。

國內外文獻有關鴉膽子活性成分的報道［1，2］，發現其果實中含有多種具有抗腫瘤活性的苦木內酯類化合物。鴉膽苦素D 具有抗虐和抗腫瘤活性，鴉膽苦醇對S180瘤株有邊緣活性［1，2］。目前市場上還未有高純度的鴉膽苦素D、鴉膽苦醇和鴉膽因H 對照品，限制了鴉膽子的深入開發和應用。本文采用制備型高效液相色譜法(Pre-HPLC)，在30 min 的分離時間內完成分離，制備了鴉膽苦素D、鴉膽苦醇與鴉膽因H 三個成分。通過熔點測定法、高效液相色譜對獲得的產品進行分析，產品純度達到98%以上，可以作為鴉膽苦素D、鴉膽苦醇與鴉膽因H 對照品使用。本方法制備的鴉膽苦素D，鴉膽苦醇與鴉膽因H 具有高效快速、產品純度高的特點，可以作為制備高純度的鴉膽苦素D，鴉膽苦醇及鴉膽因H 對照品提供參考。

1 儀器、試劑與材料

Waters Delta 4000 制備型高效液相色譜儀，Empower 色譜工作站;Waters 2695-2996 高效液相色譜分析儀，配二極管陣列檢測器(美國Waters 公司);X-4 數字顯示顯微熔點測定儀(北京泰克儀器有限公司);甲醇和乙腈均為色譜純(Fisher chemicals 公司);水為屈臣氏蒸餾水;其他試劑均為分析純。中藥鴉膽子粗提物經AB-8 型大孔樹脂和硅膠柱層析自制。3 種苦木內酯均為實驗室自制(經UV、NMR、MS、IR 鑒定，HPLC 純度不低于98%)，符合定量要求。中藥鴉膽子藥材購自廣東，經廣西師范大學生命科學院唐紹清教授鑒定為植物Brncea Javaniea L.Merr 干燥果實。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

制備型HPLC 條件:自填Microsorb C18柱(50 mm × 200 mm，5 μm);流動相:甲醇-水(體積比40∶60)，流速100 mL/min;檢測波長:270 nm;進樣量:2 mL。

分析型HPLC 條件:Microsorb C18色譜柱(4. 6 mm × 150 mm，5 μm);流動相:甲醇-水(體積比為40∶60)，流速1 mL/min;檢測波長:270 nm;進樣量:10 μL。

2.2 樣品處理

將10 kg 鴉膽子干燥果實，經過95%乙醇回流提取，所得浸膏分散于水中，用石油醚萃取三次，殘余水液稀釋過AB-8 大孔吸附樹脂，依次用水、40%、95%乙醇洗脫，收集95%乙醇洗脫液，減壓蒸干，得到鴉膽子苦木內酯粗提物450 g;苦木內酯粗提物450 g 再經過硅膠柱層析(100～200 目，柱長45 cm，內徑3 cm)，得到富含鴉膽苦素D、鴉膽苦醇與鴉膽因H 的干浸膏37 g。稱取該干浸膏10 g 甲醇溶解，配置成濃度為20 mg/mL 的溶液，過0.45 μm 微孔濾膜，供樣品分析和制備使用。

2.3 樣品分析

圖1 樣品的HPLC 圖Fig.1 HPLC chromatogram of sample

取按照“2.2”方法處理后的樣品溶液適量，用甲醇稀釋10 倍后進行分析，以鴉膽苦素D、鴉膽苦醇與鴉膽因H 對照品為對照，對色譜圖中的峰進行指認，見圖1。

2.4 制備色譜條件的優化

制備色譜條件的優化從樣品的溶解開始。通過分析型色譜來優化分離條件，然后應用線性放大技術在制備色譜中放大。通過優化色譜條件使目標化合物與干擾成分在分析型色譜中的分離度Rs大于2，確保分析型色譜條件放大后經簡單調整即可在制備型色譜中達到滿意的效果。在用反相制備色譜制備對照品時，一般來說，小的保留因子k 對制備分離更有利。本實驗中鴉膽苦素D、鴉膽苦醇與鴉膽因H 的k 分別約為2.3、4.5 和5.7。

制備色譜流動相的流速、進樣量分別按照公式計算:Fp=Fa× (Dp/Da)2，Lp=La× (Dp/Da)2(式中Fp為制備型色譜流動相流速，Fa為分析型色譜流動相流速，Dp為制備柱的直徑，Da為分析柱的直徑，Lp為制備型色譜進樣量，La為分析型色譜進樣量)［4，5］。參照上述文獻報道的方法，并結合實際制備過程中的成本以及產品純度，進一步調整得到了“2.1”下制備色譜的條件。

2.4.1 樣品溶解條件的選擇

選擇溶解樣品的溶劑，應該對樣品有良好的溶解度，不干擾樣品的分離，且容易處理。本文比較了甲醇、乙腈、丙酮、水、二甲基亞砜等溶劑，發現樣品在甲醇中溶解度很好。本實驗采用甲醇為溶劑，配成濃度為20 mg/mL 的樣品溶液。

2.4.2 流動相的選擇

分析型液相色譜向制備型液相色譜轉化時，本研究采用放大公式Xp= Xa· rp2· CL/ ra2(Xp為制備型色譜流速，Xa為分析型色譜流速，rp為制備型柱半徑，ra為分析型柱半徑，CL為制備型色譜柱與分析型色譜柱的長度比)。通過優化甲醇-水的比例、流動相流速使樣品達到需要的分離效果。根據本實驗中分析與制備色譜柱的規格，制備色譜中流動相理論流速應為113 mL/min，實際實驗中采用的流速為100 mL/min。

2.4.3 最佳進樣量的選擇

進樣量的改變由樣品溶液的濃度和進樣體積兩方面決定。在樣品濃度一定的情況下，通過增大進樣體積來增大進樣量。當進樣量增加時，目標化合物與相鄰成分的分離度會逐漸降低，影響目標化合物的分離，進樣量達到一定量時，相鄰成分無法分離［5］。

在樣品質量濃度為20 mg/mL 條件下，考察了不同進樣體積(0.5～5 mL)對分離度的影響。結果表明，0.5～2 mL 進樣體積范圍內，目標成分與干擾成分分辨率逐漸降低，峰重疊加重;當進樣體積大于2 mL 后，目標成分與干擾成分重疊嚴重，無法選取適當的切割位置，使分離的純度無法保證。因此，本實驗采用2 mL。

圖2 樣品制備HPLC 圖Fig.2 Preparative HPLC chromatogram of sample

2.5 產品純度的檢測

2.5.1 高效液相色譜分析

對照品定性分析，制備色譜所得的化合物為鴉膽苦素D、鴉膽苦醇與鴉膽因H，再經高效液相色譜檢測(按“2.1”部分分析型HPLC 條件)，采用峰面積歸一法，鴉膽苦素D 的純度為99.17%，鴉膽苦醇的純度為99.02%，鴉膽因H 的純度為98.75%。外標法定量，測得的產品質量分數分別為:98.58%、98.03%和98.01%。

2.5.2 熔點的測定

測得所制備的鴉膽苦素D、鴉膽苦醇與鴉膽因H 的熔點分別為:285～286 ℃、272～274 ℃、283～284 ℃。

2.6 結構鑒定

鴉膽苦醇:片狀結晶(甲醇-氯仿)，mp:272～274 ℃，FeCl3反應呈陽性;1H NMR (400 MHz，C5D5N)δ :1.24 (3H，s，H-18)，2.10 (2H，m，H-6)，1.71 (3H，s，H-19)，1.90 (3H，s，H-4')，2.10 (3H，s，H-5')，2.13(1H，m，H-19)，2.14，3.16 (2H，m，H-1)，2.91 (1H，d，J = 12.6 Hz，H-5)，3.61，4.92(2H，m，H-20)，3.62 (3H，s，H-23)，4.01 (1H，m，H-11)，4.12 (1H，m，H-12)，4.90 (1H，m，H-7)，5.72 (1H，s，H-2')，5.90 (1H，m，H-15);13C NMR(100 MHz，C5D5N)δ :50.3 (C-1)，193.0 (C-2)，146.1 (C-3)，128.5 (C-4)，42.7 (C-5)，29.9 (C-6)，83.4 (C-7)，41.8 (C-8)，42.9 (C-9)，46.2 (C-10)，73.4 (C-11)，76.3 (C-12)，83.1 (C-13)，51.2(C-14)，68.4 (C-15)，168.1 (C-16)，16.3 (C-18)，13.5 (C-19)，74.7 (C-20)，171.2 (C-22)，53.1 (C-23)，165.4 (C-1')，116.3 (C-2')，158.4 (C-3')，20.4 (C-4')，

27.1 (C-5')。以上波譜數據和理化性質與文獻［6，7］報道的鴉膽苦醇基本一致。

鴉膽苦素D:無色粉末，mp:285～286 ℃，FeCl3反應呈陰性;1H NMR (400 MHz，C5D5N)δ :5.97(1H，m，H-3)，1.87 (3H，s，H-22)，1.06 (3H，s，H-18)，1.25 (3H，s，H-19);13C NMR (100 MHz，C5D5N)δ :81.0 (C-1)，199.0 (C-2)，124.6 (C-3)，164.2 (C-4)，44.1 (C-5)，26.9 (C-6)，74.2 (C-7)，47.2 (C-8)，49.3 (C-10)，80.4 (C-11)，81.6(C-12)，78.3 (C-13)，83.5 (C-14)，69.1 (C-15)，172.1 (C-16)，22.3 (C-17)，18.3 (C-18)，11.4 (C-19)，70.1 (C-20)。上述波譜數據與文獻［6，7］報道基本一致，確定為鴉膽苦素D。

鴉膽因H:白色結晶，mp:283～284 ℃;1H NMR(400 MHz，C5D5N)δ :1.07 (3H，s，H-18)，1.66，2.17 (2H，m，H-6)，1.93 (3H，s，H-19)，2.91 (1H，bd，J=13 Hz，H-5)，3.69，4.95 (2H，d，J=7.5 Hz，H-20)，3.71 (1H，d，J =6.5 Hz，H-12)，4.36 (1H，s，H-1)，4.38 (1H，d，J=6.4 Hz，H-11)，5.24 (1H，m，H-7)，5.88 (1H，m，H-15)，5.96 (1H，s，H-3);13C NMR (100 MHz，C5D5N)δ :83.6 (C-1)，199.0(C-2)，125.6 (C-3)，163.7 (C-4)，43.9 (C-5)，28.5 (C-6)，79.4 (C-7)，51.1 (C-8)，45.8 (C-9)，48.6 (C-10)，76.1 (C-11)，78.3 (C-12)，84.7 (C-13)，84.1 (C-14)，71.2 (C-15)，175.3 (C-16)，11.8 (C-18)，22.4 (C-19)，70.7 (C-20)，65.0 (C-22)。以上波譜數據與理化性質文獻報道［7］的鴉膽因H 基本一致。

3 討論

隨著鴉膽苦素D、鴉膽苦醇與鴉膽因H 藥理作用研究的不斷深入，該類化合物及其對照品的需求量也日益增加。本試驗采用制備型高效液相色譜法分離得到上述三個苦木內酯單體，不僅能夠得到高純度的化合物單體，而且快速簡便、操作方便、便于收集，純度均大于98%，可作為對照品使用。本文對鴉膽子中苦木內酯類化合物進行制備分離，為進一步大量制備鴉膽子中其它重要活性苦木內酯提供了思路，也為天然產物中分離高純度的化合物單體提供了參考。

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