人源EFA6A蛋白Sec7結構域的克隆表達與純化

謝長林 芮斌 江娜 趙晨 唐雅珺 文漢

（1.安徽農業大學生命科學學院，合肥 230036；2.中國科學技術大學生命科學學院，合肥 230026）

小GTP酶廣泛地參與真核生物細胞中的各項生命活動，發揮著十分重要的作用［1］。Arf家族是一類最先被報道的小GTP酶，主要功能是參與膜運輸和細胞骨架的裝配，其成員包括Arf1-6［2］。其中，Arf6在它的信號通路中，通過調節細胞膜和細胞骨架的動力學活性來實現胞內生物膜系統的循環和細胞骨架的裝配［3］。越來越多的研究揭示，Arf6還對胞外分泌的調節［4，5］、胞質分裂［6］、腫瘤細胞的遷移［7］、細胞的吞噬作用［8］發揮著重要的作用。同其他小GTP酶一樣，一些特異性的GEFs和GAPs調節Arf6的活性，和它一起參與到細胞內的各項生命活動中。GEF的催化機制是通過剝落結合在Arf6上的GDP，使Arf6能夠重新與GTP結合，并從失活態轉變為活性態［9］。

人EFA6家族都是Arf6的GEF，包含4個成員：EFA6A、EFA6B、EFA6C和EFA6D。EFA6A在腦組織中高表達，GEF缺陷型EFA6A在神經細胞形態上有利于樹突的形成［10］。過表達EFA6A會促進海馬神經元細胞的神經棘生長［11］。它通過調節Arf6和胞外信號調節蛋白的活性，促進細胞的遷移和侵襲［12］。EFA6A在神經膠質瘤細胞遷移中也發揮作用，另一方面它通過調節自身在神經細胞中的表達量來參與到神經細胞的精加工活動中［9］。EFA6A包含3個結構域：負責定位于膜上的PH結構域、調節肌動蛋白細胞骨架裝配的Coiled-coil Motif結構域和具有催化鳥苷酸交換作用活性的Sec7結構域。這些結構域在EFA6家族中都是十分保守的［13］。

本研究擬從人腦cDNA文庫中克隆出Sec7結構域的基因序列，再亞克隆至p28a表達載體中。將重組質粒轉化至宿主菌BL21-Gold（DE3）中，IPTG誘導表達，旨在為其結構和功能的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒與細菌 p28a質粒：pet28a（Thrombin）改造后的新型載體，宿主菌DH5α和BL21-Gold（DE3）菌、人腦cDNA文庫。以上均由中國科技大學施蘊渝教授實驗室提供。

1.1.2 酶和試劑 Primer Star來自TaKaRa公司，限制性內切酶Nde I、Xho I和T4 DNA連接酶來自Fermentas公司。質粒抽提試劑盒和膠回收試劑盒是OMEGA公司產品。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學軟件分析、引物的設計與合成 從Uniprot搜索EFA6A的邊界信息，初步選取450-740 aa長度的氨基酸序列作為Sec7結構預測的起始片段。依據Jpred預測的結果，分析PDB（Protein Date Bank）中同源Sec7的結構特點，確定本研究重組表達的Sec7的邊界為506-719，共214 aa。根據已測序的人EFA6A的基因序列，設計一對針對Sec7基因片段的引物，在上游引物加入Nde I酶切位點，在下游引物中加入Xho I酶切位點，引物由上海英駿有限公司合成。上游引物：5'-ACGTCATATGGAGGACAGCCTTGGGCTGGGGGCAG-3'，下游引物：5'-GCTACTCGAGTCAGCGTCTCAGCTCCTCCTCGTCT-3'（下劃線為Nde I及Xho I酶切位點）。

1.2.2 Sec7基因的克隆 運用Touchdown PCR法（程序如表1）從人腦cDNA文庫中釣取目的基因。程序結束后用1%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳回收純化目的基因片段。目的基因片段經Nde I和Xho I雙酶切后，亞克隆至表達質粒p28a中，16℃過夜連接，將連接產物轉化至感受態細胞DH5α中，卡納抗生素平板篩選后挑取3個單克隆，將初步鑒定為陽性的克隆送至上海華大基因測序。

1.2.3 Sec7的誘導表達 比對測序結果，經序列吻合的特異性重組子編號保種。運用試劑盒抽提重組質粒并轉化至感受態細胞BL21-Gold（DE3）中。挑取單菌落接種于含50 mg/L卡那抗生素的5 mL LB培養基中37℃過夜培養。隔天，1∶20擴大培養至100 mL LB中，37℃培養至OD為0.8-0.9后，加入終濃度為0.3 mmol/L IPTG、誘導溫度16℃、時間24 h。

1.2.4 Sec7的Ni-NTA柱和分子篩純化 目的蛋白誘導24 h后，6 000 r/min離心10 min收菌，50 mL Binding Buffer （20 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，pH8.0）重懸菌體后超聲破碎8 min，13 000 r/min離心30 min取上清。當離心破碎液時，再生Ni-NTA柱，待離心結束后，取上清，流穿Ni-NTA柱。上清流穿結束后，Binding Buffer洗脫10 mL，Wash Buffer（30 mmol/L imidazole+Binding Buffer）洗脫50 mL，Elution Buffer （300 mmol/L imidazole +Binding Buffer）洗脫20 mL。將含有目的蛋白的Elution溶液濃縮至5 mL，上樣Superdex200柱，目的峰接樣后12%SDS-PAGE蛋白電泳膠查看目的蛋白狀態。

2 結果

2.1 生物信息學軟件分析結果

Sec7結構域在GEF-EFA6家族中非常保守，PDB中已知的同源Sec7的結構一般由9-11個α螺旋組成。Uniprot中提供的Sec7邊界信息為521-706。Jpred預測的Sec7結構域邊界為541-716，包含10個α螺旋，與同源的Sec7的α螺旋數相符。綜合所有信息學軟件的分析結果，為了保證所有的α螺旋能夠被完整表達，此次試驗向N、C兩端各自延長了數量不等的氨基酸，最終確定邊界為506-719（圖1）。

圖1 EFA6A的結構域全圖

2.2 Sec7基因的克隆

以人腦cDNA文庫為模板，利用特異性引物進行PCR引物擴增，擴增產物經1%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約700 bp左右的地方有一條特異性的DNA條帶（圖2），與預期的結果一致。

圖2 PCR電泳結果

2.3 表達載體的構建、PCR鑒定和測序

雙酶切目的片段回收純化后與p28a載體連接，將重組質粒轉化至感受態DH5α中，過夜37℃培養。挑取3個單克隆，菌液PCR結果均為陽性克隆（圖3），同時送樣測序。測序結果表明，3個陽性克隆的目的基因序列與Sec7（506-719）基因序列完全吻合。

圖3 菌液PCR鑒定結果

2.4 Sec7蛋白的Ni-NTA柱、分子篩純化和SDSPAGE電泳分析

將表達質粒轉化至感受態BL21-Gold（DE3）細胞中，誘導表達后，經Ni-NTA柱純化的蛋白組份跑SDS-PAGE電泳。結果（圖4）表明，上清液在約25 kD處有一條明顯的特異帶，與目的蛋白分子量基本吻合。從流穿液的電泳結果來看，目的蛋白與Ni柱的結合效果良好，且Elution洗脫液中目的蛋白純度較高。500 mmol/L EDTA洗脫液中沒有發現目的蛋白的存在，說明目的蛋白已經被洗脫干凈。

圖4 Ni-NTA柱純化的SDS-PAGE電泳圖

將Elution Buffer的洗脫液濃縮至5 mL，上樣Superdex200柱，波長280 nm層析圖譜結果（圖5），接樣后取目的峰的峰尖處蛋白樣品，SDS-PAGE電泳查看蛋白狀態。

圖5 Sec7蛋白Superdex200分子篩 U280峰圖

盡管Elution的SDS-PAGE電泳結果顯示，Ni柱純化后的目的蛋白純度較高，但是從波長280 nm層析圖譜可以看出，在Sec7目的峰出現前仍有較多雜質的峰，需要分子篩進行后續純化。將Sec7的目的峰接樣，總體積約為12 mL，取樣SDS-PAGE電泳結果（圖6）顯示蛋白質條帶單一，無雜帶出現，經檢測蛋白純度高于95%。將分子篩后的樣品，超濾濃縮后至500 μL，目的蛋白濃度為7 mg/mL。蛋白質每經一次純化理論損失量約為25%，經換算，Sec7上清表達量應為70 mg/L（LB液體培養基的體積）。

圖6 分子篩純化SDS-PAGE電泳圖

3 討論

Sec7結構域在EFA6家族里是高度保守的一個結構域，作為GEF的核心結構域，主要承擔著催化鳥苷酸交換反應的功能。目前的PDB中還沒有EFA6家族Sec7結構域的結構信息，這局限了我們了解Sec7結構特點及結構與其功能之間的聯系。

現有的解析蛋白質結構的方法大都建立在得到高純度、穩定、均一的重組蛋白的基礎上。運用現有的生物信息學技術，選擇恰當的邊界、合適的載體以及相對應的表達純化方法是獲得理想重組蛋白的重要手段。

本試驗在邊界選擇方面綜合了生物信息學軟件Jpred的預測結果、Uniprot提供的信息和PDB中同源Sec7的結構特點，選取適宜的結構域邊界，設計引物，通過優化PCR的程序，成功從人腦cDNA文庫中擴增出了Sec7的目的基因片段。根據后續的試驗結果顯示，此次邊界的選擇有利于Sec7的高效表達，突出了現有生物信息學軟件對此次試驗的指導意義。

試驗還使用了一種改造后的新型表達載體p28a，p28a載體是由pET28a（+）載體改造而來。pET28a（+）載體表達的重組蛋白一級序列為：MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM+目的蛋白一級序列（下劃線為Thrombin酶識別的氨基酸序列），經酶切后的重組蛋白一級序列為GSHM+目的蛋白。經過改造后的p28a載體表達的重組蛋白一級序列為：MGHHHHHHM+目的蛋白，N端含有6個His的標簽，用于Ni柱純化，純化后標簽無需酶切，避免了蛋白在酶切時發生的沉淀和降解等不利因素，同時也降低了純化蛋白的經濟成本。

Ni-NTA柱純化后，蛋白狀態經SDS-PAGE檢測純度較高，但從分子篩的波長280 nm層析圖譜上看，在目的峰出現以前仍然有很多的雜質峰，這不僅反映了SDS-PAGE檢測方法的缺陷，更突出了分子篩二次純化的必要。后者在起純化作用的同時，也能反映蛋白的純度、狀態和穩定性，為得到優良的蛋白樣品提供了有力保障。

4 結論

通過優化PCR程序成功從人腦cDNA文庫擴增出人EFA6A的Sec7結構域的基因序列。將目的基因片段亞克隆至p28a表達載體中，測序結果與NCBI中的序列完全吻合。將表達載體轉化至BL21-Gold（DE3）中，在終濃度0.3 mmol/L IPTG、16℃、24 h情況下成功表達。重組的Sec7表達量高（70 mg/L），易于純化，狀態穩定，性質均一，純度高于95%。

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