1,3-二氯-2-丙醇對睪丸間質細胞R2C活性及孕酮合成的影響

白 順，孫建霞，白衛(wèi)濱*，鄒飛雁，張齊好，黃亞東

(1.暨南大學發(fā)育與再生生物學系，廣東 廣州 510632；2.廣東工業(yè)大學輕工化工學院，廣東 廣州 510006；3.暨南大學食品科學與工程系，廣東 廣州 510632；4.暨南大學醫(yī)藥生物技術研究開發(fā)中心，廣東 廣州 510632)

食品中的氯丙醇的污染主要來自以鹽酸水解蛋白工藝生產的醬油、“雞精”等人們日常生活中常見的調味品[1-3]。2001年經糧農組織/世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯合專家委員會(JECFA)綜合評價得出氯丙醇類同系物1,3-二氯-2-丙醇(1,3-dichloro-2-propanol，1,3-DCP)可引起肝臟和腎臟毒性[3-4]，并具有遺傳毒性、發(fā)育毒性和致癌性[5-7]，因此國際上各主要國家對調味品乃至食品中氯丙醇都有一定的限量標準[8-9]。此前Omura等[10]給予大鼠長期喂食含1,3-DCP的水后發(fā)現其能降低精子數，說明1,3-DCP是大鼠的睪丸毒物，對生殖系統有一定的潛在影響，但其具體的毒理機制尚不明確。本研究通過1,3-DCP對體外培養(yǎng)的大鼠睪丸間質細胞R2C毒性損傷情況，探討氯丙醇引起的生殖毒性機制，為氯丙醇的食品安全評價提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

R2C細胞由暨南大學醫(yī)藥生物技術研究開發(fā)中心提供。

1,3-DCP(#1100996，純度為98%) 上海晶純公司；F12培養(yǎng)液、胰酶、胎牛血清、馬血清、肌氨酸鈉 美國Sigma公司；噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO) 美國Amresco公司；EDTANa2、Triton X-100、Tris 美國Genview公司；低熔點瓊脂糖 美國FMC公司；正常熔點瓊脂糖 西班牙Biowest公司；孕酮放射免疫試劑盒 北京北方生物技術研究所。

CO2培養(yǎng)箱、酶標儀 美國Thermo公司；GC-1200 γ放射免疫計數儀 安徽中科中佳公司；DDL-5低溫離心機 上海安亭公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測1,3-DCP對R2C細胞增殖率

取對數期的R2C細胞懸液調整濃度為2×104個/mL，以每孔200μL細胞懸液接種96孔板。培養(yǎng)24h后加入用無血清培養(yǎng)液稀釋的1,3-DCP，使每孔終濃度分別為0.5、1、2、4、6mmol/L并混合均勻。每個濃度設3個平行孔，并設有空白組(只加200μL培養(yǎng)基)和對照組(加200μL細胞懸液，不加藥)。藥物作用48h后，每孔加入20μL 5mg/mL MTT。繼續(xù)培養(yǎng)4h后吸去孔內液體，每孔加200μL DMSO溶解沉淀后于脫色搖床搖勻10min，酶標儀檢測570nm波長處的吸光度。按下式計算細胞生長抑制率。

通過SPSS軟件分析得出1,3-DCP刺激細胞48h后的IC25、IC50和IC75。

1.2.2 單細胞電泳法(single cell gel electrophoresis，SCGE)檢測1,3-DCP對R2C細胞DNA損傷作用

R2C細胞培養(yǎng)至對數期，調整細胞濃度為1×105個/mL，以每孔1mL接種到6孔板內。培養(yǎng)24h后加1,3-DCP，使其終濃度為IC25、IC50和IC75。培養(yǎng)4h后收獲細胞，PBS重懸，冷卻用于SCGE實驗。

配制0.8%常溫熔點瓊脂糖溶液，加熱熔化后，冷卻至45℃，取100μL滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，4、10min后取下蓋玻片作為第一層；取104個細胞與75μL 0.8%的低熔點瓊脂糖溶液在37℃條件下混勻，迅速滴在第一層瓊脂糖上，加上蓋玻片，4℃、10min后取蓋玻片形成第二層膠。

將玻片浸入預冷的裂解液(2.5 m o l/L N a C l，100mmol/L Na2EDTA，10mmol/L Tris，1% Triton X-100及10% DMSO組成，臨用前配用，pH10)，4℃靜置1h。取出玻片，蒸餾水洗3次后放入電泳槽內，加電泳液(1mmol/L Na2EDTA，300mmol/L NaOH，pH13)并使電泳液面高出玻片0.25cm，靜置20min后25V 200mA電泳15～20min。取玻片置于0.4mol/L Tris(pH7.5)溶液中洗滌3次，每次10min。每片滴加20μL 25μg/mL EB進行DNA染色，蓋上蓋玻片后熒光顯微鏡下觀察拍照。CASP軟件分析電泳結果。

1.2.3 放射免疫(radioimmunoassav，RIA)檢測1,3-DCP對R2C細胞合成孕酮的影響

R2C細胞培養(yǎng)至對數期，調整細胞濃度為106個/mL，以每孔1mL細胞懸液接入6孔板，培養(yǎng)24h后更換分別含IC25、IC50和IC75濃度1,3-DCP的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)4h或24h后胰酶消化細胞，1500r/min離心5min后收取上清，放于－20℃保存。按孕酮放射免疫試劑盒進行孕酮的測定。

1.2.4 統計學處理

運用SPSS軟件19.0進行統計分析，采用單因素方差分析結果，檢驗水準α=0.05。

2 結果與分析

2.1 1,3-DCP對R2C細胞的生長抑制作用

圖 1 不同濃度1,3-DCP刺激R2C細胞48h后的細胞形態(tài)圖(×200)Fig.1 Morphology of R2C cells subjected to treatment of 1,3-DCP at various concentrations for 48 h (×200)

不同濃度的1,3-DCP作用R2C細胞48h后，細胞生長受到不同程度的抑制。由圖1可知，隨著濃度的增加，細胞形態(tài)和數量均發(fā)生了變化。細胞形態(tài)逐漸變圓，且貼壁不穩(wěn)定，隨著濃度的增加，此現象越明顯，同時細胞抑制率隨著1,3-DCP濃度的增大也逐漸增大(表1)。通過SPSS軟件分析得出1,3-DCP對R2C細胞的IC25、IC50、IC75分別為(1.161±0.046)、(1.897±0.018)、(3.100±0.040)mmol/L。

表 1 不同濃度1,3-DCP對R2C細胞生長抑制率的影響Table 1 Inhibitory effect of 1,3-DCP on the growth of R2C cells

2.2 1,3-DCP對R2C細胞DNA損傷的作用

圖 2 不同濃度1,3-DCP刺激4h后對R2C細胞DNA損傷作用Fig.2 Damage of DNA in R2C cells after treatment with 1,3-DCP

圖 3 不同濃度1,3-DCP刺激4h后對R2C細胞尾部DNA含量、尾長、Olive尾距(OTM)的影響Fig.3 Effect of 1,3-DCP on tail DNA content, tail length and Olive tail moment in R2C cells

不同濃度1,3-DCP刺激R2C細胞4h后，細胞拖尾的長度隨著濃度的增加而增大(圖2)。通過CASP軟件分析尾部DNA含量、尾長、尾距以及Olive尾距(OTM)等數據得出(圖3)，各濃度組對細胞DNA有明顯的損傷作用，并具有統計學意義。

2.3 1,3-DCP對R2C細胞分泌孕酮的影響

放射免疫結果顯示，不同濃度1,3-DCP作用R2C細胞4h后，各濃度組能夠明顯影響R2C細胞孕酮的合成(圖4)。而在作用24h后，各濃度組孕酮合成量顯著降低，且隨著濃度的增加，降低也更明顯，各濃度組與對照組相比，有顯著性差異(P＜0.05)(圖5)。

圖 4 不同濃度1,3-DCP刺激4h后對R2C細胞孕酮合成的影響Fig.4 Effect of 1,3-DCP on progesterone production of R2C cells for 4 h

圖 5 不同濃度1,3-DCP刺激24h后對R2C細胞孕酮合成的影響Fig.5 Effect of 1,3-DCP on progesterone production of R2C cells for 24 h

3 討 論

前期研究[11]發(fā)現氯丙醇毒性作用的靶器官為腎臟和生殖系統。目前，1,3-DCP的毒性和致癌性實驗資料顯示，1,3-DCP可以顯著的增加肝臟、腎臟等惡性腫瘤的發(fā)生[12]。一系列細菌和哺乳動物體外系統實驗中均表明1,3-DCP具有體外致突變作用和遺傳毒性作用[13]。大鼠體內實驗表明，1,3-DCP對大鼠雄性生殖系統具有毒性，但未對睪丸間質細胞進行體外毒理評價[10]，本研究通過對睪丸間質細胞R2C的生物活性及其功能的影響來探討1,3-DCP的毒性作用。

1,3-DCP刺激劑量的選擇是依據Ramy等[14]對氯丙醇的另一同系物3-氯-1,2-丙二醇(3-MCPD)的研究來確定劑量范圍。3-MCPD與1,3-DCP都有生殖毒性和致癌性，且1,3-DCP體外研究目前還比較少，因此本實驗參考3-MCPD的刺激劑量范圍來探討1,3-DCP的毒性作用。

研究首先發(fā)現1,3-DCP能抑制R2C細胞的增殖，并且隨著濃度的增加，抑制也越來越明顯，推測1,3-DCP可能是通過影響睪丸間質細胞的活性來影響生殖系統的正常運行。此外，單細胞電泳結果表明1,3-DCP作用的R2C細胞與對照組相比DNA受到明顯的損傷，這說明了其對睪丸間質細胞具有遺傳毒性作用。孕酮是睪酮合成的第一步，通過檢測孕酮水平可間接說明睪酮的分泌量[15-16]。有研究[17]表明，體外培養(yǎng)睪丸間質細胞4h時睪酮分泌量達到最大，本實驗首先檢測1,3-DCP作用R2C細胞4h后孕酮的分泌量，同時也設置了24h時間點，目的是探討1,3-DCP對R2C細胞孕酮分泌量的影響有沒有時間依賴性。研究結果顯示1,3-DCP刺激4h或24h后，各濃度組R2C細胞合成的孕酮與對照組有明顯差異，濃度越高，差異也越明顯。結果說明1,3-DCP能抑制R2C細胞孕酮的合成，進而抑制睪酮的合成，且抑制呈時間—劑量效應。

通過以上結果可猜測，1,3-DCP是通過對R2C細胞孕酮合成過程中關鍵蛋白DNA的損傷來達到影響孕酮合成的作用。今后準備通過對孕酮合成中關鍵蛋白的mRNA水平和蛋白水平的研究來進一步探討1,3-DCP的毒性作用機理，從而為闡明1,3-DCP調控睪丸間質細胞孕酮分泌具體機制奠定基礎。

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