水稻紋枯病菌毒素提取及其對水稻的毒性

李 路，王 玲，劉連盟，侯恩慶，肖丹鳳，黃世文

(1.廣西大學 農學院，廣西南寧 530003;2.中國水稻研究所，浙江杭州 310006)

水稻紋枯病是遍及全球的水稻病害。目前該病已在亞、非、歐、美各洲水稻種植國家普遍發生，一般減產10%～30%，嚴重時可達50%，對水稻生產威脅很大。隨著高產、矮稈、多蘗良種的推廣以及種植密度和施氮量的增加，其危害日趨嚴重，造成很大的損失［1］。該病害由水稻紋枯病菌引起，紋枯病菌在生長代謝過程中會產生毒素。研究表明，水稻紋枯病菌粗毒素對水稻有明顯毒害作用，不僅能引起紋枯病的相似病斑，而且抑制胚根生長，致使幼苗萎蔫［2］，這顯示毒素在病菌致病過程中起非常重要的作用。長期以來，對水稻紋枯病的防治主要依賴于化學藥劑和栽培措施，但防治效果不甚理想［3］。選用抗病品種是防治水稻紋枯病發生為害的有效途徑，也是綜合防治的關鍵措施［2］。但之前有關紋枯病抗性鑒定的方法如苗期、成株期鑒定，溫室、大田接種等存在費時、費力、費工、出結果慢的缺點，且關于該病抗性品種的快速鑒定方法在國內外鮮見報道［4］。通過探究不同致病力的毒素對不同抗性的水稻種子發芽率、胚根及胚芽生長的影響，旨在探索水稻紋枯病簡便、快速、有效的鑒定方法。本試驗為水稻抗紋枯病初篩毒素處理進行探索，故利用的材料是已知不同抗性的品種。

現將有關試驗結果總結如下。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試水稻品種 (類型):中浙優1號 (雜交稻，較感紋枯病)、秀水09(粳稻，較感紋枯病)、ZH5(秈稻，較抗紋枯病)。

供試菌株:水稻紋枯病菌 GD-118(強致病力)、YN-7(中等致病力)、YN-3(弱致病力)。

以上材料均為本實驗室保存。

1.2 粗毒素制備

將3個菌種接種到PDA培養基上，27℃下培養至菌絲長滿平板。產毒培養基為改良的Richard培養基:KNO310 g，KH2PO45 g，MgSO4·7H2O 2.5 g，Fe2(SO4)30.02 g，蔗糖 50 g，蒸餾水1 000 mL，pH值6～7。從平板菌落邊緣取直徑為5 mm的5塊菌絲塊至50 mL改良Richard培養基中，27℃下黑暗培養15 d，每天人工振蕩2次。

粗毒素提取參照徐敬友等［4］方法:將培養濾液加熱，產生白色沉淀后再用濾紙過濾。在濾液中加入30 g活性炭，4℃條件下靜置吸附12 h，再以8 500 r·min-1離心15 min。然后，將活性炭沉淀用等體積甲醇洗脫，再將洗脫液于60℃下旋轉蒸發濃縮，獲得黃色漿狀物即為水稻紋枯病菌粗毒素。

1.3 粗毒素生物活性測定

1.3.1 粗毒素對水稻種子發芽的影響

將3個菌種粗毒素分別稀釋10，50和100倍。取10 mL毒素稀釋液置鋪有1層濾紙 (直徑10 cm)的培養皿中，重復3次，以蒸餾水為對照。選擇健康飽滿的上述粳稻、秈稻和雜交稻種子，先將水稻種子用清水預浸2 h，撈起瀝干水后，浸入3%H2O2中消毒24 h后撈起，用蒸餾水沖洗干凈，然后置于不同毒素稀釋液的培養皿內，每皿30粒。在25℃下催芽72 h，記錄種子的根長和芽長，計算發芽率。根長和芽長均超過0.50 cm(含0.50 cm)記為發芽。計算公式如下:

發芽抑制率/%=100×(對照種子發芽率 -處理種子發芽率)/對照種子發芽率。

1.3.2 粗毒素對胚根和胚芽生長的影響

用3%H2O2對3種水稻種子消毒24 h，無菌水沖洗，30℃下清水浸種催芽48 h。將種子置于鋪有濾紙的含10 mL毒素稀釋液的培養皿中，每皿15粒種子，30℃下黑暗培養48 h，重復3次，以蒸餾水為對照，測定胚根和胚芽長度。計算公式如下:

胚根 (芽)伸長抑制率/%=100× (對照胚根或胚芽平均長度-處理胚根或胚芽平均長度)/對照胚根或胚芽平均長度。

2 結果與分析

2.1 粗毒素對水稻種子發芽的影響

3個菌種的毒素粗提物均對水稻種子發芽有不同程度的抑制作用，并且抑制率隨著毒素濃度的提高而增大。不同菌株產生的毒素毒性不相同，毒素毒性強弱依次為GD-118＞YN-7＞YN-3。GD-118的毒素稀釋10倍后能完全抑制中浙優1號和秀水09的種子發芽。同種毒素相同濃度下，不同類型的水稻種子表現出不同的抗性，抗性從強到弱依次為ZH5＞秀水09＞中浙優1號。YN-3毒素稀釋100倍時，ZH5的種子全部能發芽 (表1)。

表1 3種紋枯病菌粗毒素對不同類型水稻種子發芽的影響

2.2 粗毒素對胚根、胚芽生長的影響

催芽后的種子浸入毒素稀釋液后，胚芽和胚根的伸長受到了不同程度的抑制。由表2可知，YN-3毒素的毒性相對最弱，毒性最強的GD-118毒素稀釋10倍后完全抑制了中浙優1號和秀水09胚根的生長。且毒素對于胚根的抑制程度大于對胚芽的抑制。與發芽率結果相似，ZH5胚根和胚芽的生長對紋枯病菌毒素表現出了較好的耐受性。

表2 3種紋枯病菌粗毒素對不同類型水稻胚根、胚芽生長的影響

3 小結和討論

試驗結果顯示，不同抗性類型的水稻品種種子的發芽率、胚根、胚芽生長對相同菌株相同濃度的粗毒素的敏感性反應是不同的。抗性強的品種，對毒素毒性的耐受性就越高，反之亦然。不同致病力的紋枯病菌菌株產生的粗毒素其毒性是不同的，致病力越強，產生的毒素毒性越高。

本實驗僅提取了粗毒素用于試驗，未對離體葉片的影響進行研究。黃文文等［3］將粗毒素接種在4葉期水稻離體葉片上，3 d后發現葉片上產生病斑，也驗證了毒素的致病性。另外，本研究的供試品種較少，今后需進一步研究更多水稻品種對毒素的敏感性和抗感標準，使毒素在紋枯病抗性鑒定中得到更好地應用。對于紋枯病毒素的成分，很多報道的看法不一［3—7］。劉洪濤等［6］認為采用培養產物的毒素混合物比用提純的單一毒素會更接近病菌在寄主上分泌毒素的組分狀態。菌株毒素與品種抗性互作是可以鑒別出水稻品種對紋枯病的抗性的，用紋枯病菌產生的毒素來進行水稻品種或資源的抗紋枯病鑒定是可行的，結果與其他接種鑒定基本一致。

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