pH平面光極在生物擾動存在下水/沉積物體系中的應用

沈萬斌，周楠楠，李一楠，郭志勇，李耀睿，花修藝，董德明

地下水資源與環境教育部重點實驗室/水資源與水環境吉林省重點實驗室/吉林大學環境與資源學院，長春 130012

0 前言

pH是表征水環境生物地球化學特征的重要參數之一［1］。水體中的生物擾動主要指水/沉積物界面附近的底棲動物所產生的擾動作用，其對上覆水/沉積物體系中物質的遷移和微環境的物理與化學特征均有顯著影響［2－3］。體系的pH分布特征也會受生物擾動的影響而發生顯著改變，進而影響體系污染物的環境地球化學行為和遷移轉化特征［4］。因此生物擾動存在下沉積物中pH等重要環境地球化學參數的時空分布與變化規律開始受到越來越多的關注［5－8］。傳統電化學測量法只能對上覆水和沉積物pH進行一維的破壞性測量。近年來，用于醫學和生物學等領域的熒光平面光極技術開始被應用于環境領域［9－13］。其基本原理是利用熒光物質與不同濃度的待測物質作用前后其熒光波長或強度發生改變，且這種改變可定量反映待測物含量［14］；把這些熒光物質制成平面傳感膜（平面光極），通過采集和處理傳感膜的熒光圖像可得到待測物的二維定量分布圖［15］。目前已有少量用平面光極進行沉積物pH等參數二維分布測量的研究，但都集中在海洋沉積物上，對淡水沉積物的研究未見報道［16－17］。上述研究多是基于熒光絕對強度進行定量，因而存在光學路徑、背景光、光漂白和光源穩定性等因素會影響結果準確性和穩定性的缺陷［18］。鑒于此，本研究首先對傳感膜制備方法和熒光圖像采集與定量方法進行改進，構建用于淡水環境的pH二維分布監測系統，并利用該系統研究有生物擾動存在的模擬水/沉積物體系中pH的二維時空分布特征，以期進一步了解生物擾動對微環境地球化學特征的影響，進而深入認識水環境中污染物的遷移轉化規律。

1 材料與方法

1.1 pH平面光極系統的制作

pH平面傳感膜的制備方法參考文獻［16，19－20］，簡述如下：先把聚乙烯醇（PVA）、烯丙醇、戊二醛和鹽酸混合反應，所得凝膠產物平鋪于聚酯薄膜表面，形成連有乙烯基的PVA膜；然后以8－羥基－1，3，6－三磺酸芘鈉（HPTS）為熒光指示劑，先與五氯化磷反應生成磺酰HPTS，磺酰HPTS再與丙烯胺反應，生成HPTS－丙烯胺交聯劑；最后把連有乙烯基的PVA膜浸泡在HPTS－丙烯胺交聯劑、過二硫酸銨、丙烯酰胺和四甲基乙二胺的混合溶液中，使HPTS化學交聯到PVA膜上。與文獻相比，本研究在傳感膜制作過程中主要有2點改進：一是在0℃制備連有乙烯基的PVA凝膠，并通過凍干來干燥PVA膜，避免了溫度對反應的影響，也保證了PVA膜的均一性；二是同樣用凍干方式獲取HPTS－丙烯胺交聯劑，避免了產物的分解和轉化。這些改進有效提高了傳感膜的穩定性和熒光性能。

用熒光分光光度計（F－2700，日立）測定所制備的pH傳感膜在不同pH的磷酸鹽緩沖溶液中的熒光激發和發射光譜，確定其最大激發和發射波長及最佳pH檢測范圍。然后選擇6.6和8.2分別作為較低和較高pH值的代表，檢測傳感膜對pH變化的響應時間、可逆性和穩定性。即在把傳感膜放入pH為8.2的緩沖溶液中浸泡30s后，每隔3s檢測一次熒光強度，連續監測10次；再把傳感膜取出并用去離子水潤洗后轉移到pH為6.6的緩沖溶液中浸泡30s，同樣每3s檢測一次熒光強度至10次；再把該膜經潤洗后放回pH為8.2的緩沖溶液中進行同樣測定，如此循環測試6次；最后再把該傳感膜在4℃下保存15d后進行同樣測定。基于傳感膜的pH平面光極監測系統包括待測裝置（傳感膜）、光源和圖像采集裝置。傳感膜的敏感面與待測物（底泥）直接接觸，豎直放置，另一面面向光源和圖像采集裝置。紫外光源為波長可調的300W氙燈（130Xe，蘇州一村光電），圖像采集裝置為高分辨率數碼相機（佳能EOS 5DMark II，配50mm鏡頭）。根據傳感膜的最大發射波長，相機鏡頭前放置中心波長為511nm的濾光片。為避免反光影響，相機正對傳感膜而光源與傳感膜觀測面呈30°角。所采集 的 圖 像 用 Image－Pro plus（6.0 版，Media Cybernetics Inc.）軟件進行分析和計算，得到pH的平面分布等值線圖。

1.2 生物擾動下水/沉積物模擬體系pH二維時空分布的監測

淡水沉積物樣品采自長春南湖，取表層沉積物，過60目篩除雜質，然后冷凍處理去除沉積物中可能存在的底棲生物和蟲卵。擾動生物顫蚓與沉積物采自同一地點，所采顫蚓在微量礦物鹽（MMS）溶液［5］中培養適應一周后再進行實驗。

用長、寬、高分別是10、10和20cm的自制石英杯模擬水/沉積物體系。先把pH傳感膜（10cm×15cm）放入杯中，其非敏感面緊貼石英玻璃壁。再向燒杯中小心加入10cm深已均質化的沉積物，使沉積物緊密接觸傳感膜的敏感面；在沉積物上方小心加入深度為5cm的MMS溶液和約600條顫蚓。顫蚓在模擬裝置中適應24h后再開始計時和圖像采集。圖像采集在遮光條件下分別在2個選定的波長下進行。采集時在傳感膜后2cm處放置黑色擋光片，并把石英杯除觀測面外用黑布包裹。圖像采集每24h一次，連續進行14d。在此期間，用毛細管向裝置的上覆水中緩慢通空氣（拍照時除外），以保證生物的活性。模擬實驗裝置和圖像采集系統如圖1所示。

2 結果與討論

2.1 pH平面傳感膜的熒光特征和基本性能

2.1.1 不同pH下平面傳感膜的熒光特征

不同pH下傳感膜的熒光光譜見圖2。通過對傳感膜熒光光譜的初步掃描并結合文獻［20］，可確定傳感膜的最大發射波長在511nm附近。以511 nm為檢測波長，在系列pH緩沖溶液中測得的傳感膜激發的光譜見圖2A。由圖可見，所制備的傳感膜有兩個最大激發波長，分別為404nm和453nm，且這2個波長所激發熒光的強度均與pH相關。這2個波長分別對應膜上HPTS的酸式和堿式形態的最大激發波長［6］。分別以404nm和453nm為激發波長，在系列緩沖溶液中測得的傳感膜的發射光譜見圖2B和C，可知：2個激發波長下傳感膜的最大熒光發射波長均在511nm附近，且激發波長為404nm時傳感膜的熒光強度隨pH的增加而減小；而激發波長為453nm時熒光強度隨pH的增加而增加。

圖1 有生物擾動存在的水/沉積物模擬體系的實驗裝置和熒光圖像采集系統Fig.1 Simulated freshwater/sediment microcosm and the fluorescence image acquisition system

圖2 不同pH下pH平面傳感膜的熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectra of pH planar sensor at different pH values

由于該傳感膜有2個最大激發波長，且這2個波長的熒光強度隨pH呈相反變化趨勢。因此為了提高檢測的靈敏度，可將這2個波長的熒光強度進行差減，建立熒光強度差與pH的關系，見圖2D。由圖可見，熒光強度差與pH間呈近似“S”型變化，其中在pH為6.2到8.6的范圍內可根據差值對pH進行定量，而該范圍恰好也是天然水的常見pH范圍。在pH為6.6到7.8的范圍內，差值隨pH呈近乎線性的變化，此時傳感膜具有最高pH檢測靈敏度。

2.1.2 pH平面傳感膜的響應時間、可逆性和穩定性

圖3為對pH平面傳感膜的響應時間、可逆性和穩定性的測試結果。由圖3可見：傳感膜的響應時間很短，小于30s（浸泡時間）；傳感膜具有很好的可逆性，每個pH轉換周期結束后其熒光強度差值基本不變，兩批測定的2個pH的熒光強度差值的相對標準偏差均不超過1.3%；傳感膜也具有較好的穩定性，15d前后進行的兩批測定的結果較接近，其中pH＝8.2時兩批測定的熒光強度差值平均值的相對偏差為7.9%，pH＝6.6時兩批測定的強度差值平均值的相對偏差為4.4%。與類似研究得到的熒光pH平面傳感膜相比，本研究所得傳感膜的響應時間、可逆性和穩定性等性能更優或與之接近。如Zhu等［7，16］制備的pH平面傳感膜需1min才能達到正常熒光響應值的90%，200次循環測定的偏差為5%～9%；Stahl等［17］制備的傳感膜的響應時間＜200s，連續測定的標準偏差為2%～7%，15h信號強度降低8%，可穩定使用的時間＞3d；Str?mberg等［20］的傳感膜在pH 為6.6到7.7的范圍內響應時間約為100s。本研究所制備的pH傳感膜的快速響應及良好的可逆性和穩定性保證了它可以用于水/沉積物體系中pH二維分布的連續實時監測。

2.2 pH平面光極系統在生物擾動下的淡水/沉積物體系中的應用

單一激發波長下采集的熒光圖像會受光路徑、背景光、光漂白和光源穩定性等影響，不能準確反映樣品的真實信息［21］。由2.1.1可知，本傳感膜的2個最大激發波長所激發的熒光強度差與pH間存在可定量的關系。因此，pH平面光極的二維熒光圖像可采用同樣方法處理，即在511nm處分別采集激發波長為453nm和404nm的熒光圖像，把2個圖像轉化為浮點圖后進行差減，根據差值圖中熒光強度差與pH間的定量關系，得到pH二維分布等值線圖。這不僅提高了檢測的靈敏度，也克服了前述單一激發波長下直接采集圖像的缺陷。

圖3 pH平面傳感膜在2個pH下的交替響應Fig.3 Response of pH planar sensor to two alternant pH values

圖4為模擬體系第6天的原始熒光圖像及處理后圖像：圖4A和B分別是激發波長為453、404nm時體系的熒光圖像（511nm處）；圖4C為A減B的差值圖；圖4D為C添加偽色后得到的pH二維分布等值線圖。對比圖4A和B可看出：兩圖均為上覆水熒光強度高而沉積物熒光強度低；但A的上覆水與沉積物的熒光強度差別較大而B中兩者強度更接近。這也說明直接采集的圖像存在前述背景光干擾等因素。圖4C中，上覆水和沉積物間的亮度差異減小，表明背景光等干擾因素基本被克服。從圖4D可直觀看出：沉積物主體pH較低，為6.6～7.0，且隨深度增加有所增加；上覆水pH較高，為7.5～7.8；在水/沉積物界面附近pH變化劇烈。可見，利用本平面光極系統及圖像處理方法，可得到直觀反映體系pH二維分布特征的pH分布圖。

2.3 生物擾動下水/沉積物模擬體系pH的分布與變化特征

圖4 平面光極系統所采集的水/沉積物體系的熒光圖及計算所得的pH二維分布圖Fig.4 Fluorescence images obtained by planar optode in water/sediment system and the calculated two－dimensional pH isograms

圖5 生物擾動存在下水/沉積物體系中pH的二維時空分布Fig.5 Two－dimensional spatial and temporal distribution of pH in bioturbated water/sediment system

利用平面光極系統對水/沉積物模擬體系pH二維分布連續14d監測的結果見圖5。總體上上覆水pH較高而沉積物pH較低，上覆水pH的時空變化較大而沉積物pH的變化較小，與很多類似研究結果一致［8，16－17］。對于沉積物而言，其主體pH 一般為6.6～7.0且時空變化小，體現了其對pH較強的緩沖能力。由于沉積物在裝入實驗裝置前進行了均質化，所以前2d沉積物pH的空間分布很均勻。從第3天開始，由于體系中（特別是界面附近）的各種反應，沉積物開始呈表層pH略高而下層略低的趨勢［22］。實驗后期，特別是12d以后，除界面附近外，沉積物pH的空間分布重新趨于均勻，這主要是擾動生物的混合作用的結果［23］。類似趨勢從水/沉積物界面的形狀也可看出。對于上覆水而言，其pH一般為6.6～8.0，且時空變化較顯著。總體上，上覆水pH隨時間先升高，后逐漸下降并趨于穩定；沉積物附近上覆水pH與上覆水主體pH間呈較大差異，體現了沉積物對上覆水pH的影響。第1d上覆水pH與沉積物基本一致，這主要是由于填裝實驗裝置時的混合作用以及此時主要在沉積物表層活動的擾動生物的作用而導致的沉積物和水間的物質交換。底層水pH較低可能還與沉積物顆粒表面一些低價金屬的釋放和氧化有關［4，7，18］。第2－8天，上覆水pH逐漸升高，主要是由于上覆水中顆粒物的沉降（主要是前3d），以及沉積物中氨等成分的釋放（前7d）［7，24］；第8天起，隨著使pH 升高的因素影響的逐漸結束，上覆水主體pH受底層上覆水擴散作用等的影響而逐漸下降，并最終穩定在7.5附近；界面附近上覆水pH由于沉積物的緩沖作用及沉積物中釋放的低pH孔隙水的作用而一直較低（約7.4）。

擾動生物顫蚓在模擬體系中主要起搬運混合顆粒物與溶質、降低溶解氧和增加有機質的新陳代謝作用［25］。搬運混合作用一方面會使沉積物內部（孔隙水）、水/沉積物界面附近甚至上覆水主體的pH趨于均一［26］，如前述上覆水中的懸浮顆粒導致上覆水pH下降、界面附近沉積物對上覆水pH的影響等均有生物擾動的混合作用的貢獻；另一方面又會促進沉積物中物質向上覆水釋放、或把上覆水中的物質輸送到沉積物中，使這些物質由于氧化還原條件等條件的改變而可能發生涉及H＋轉移的化學反應，改變其周圍的pH［27］，如顫蚓可促進厭氧沉積物中Fe2＋等低價金屬釋放到界面附近并發生氧化，降低體系（特別是界面附近上覆水）的pH［4，18］。顫蚓的新陳代謝活動主要起降低體系氧化還原電位的作用［5］，能通過影響一些化學反應的平衡而影響體系pH，如顫蚓的存在會促進沉積物中的反硝化作用，使氮轉化為氨并釋放到上覆水，提高體系的pH［7，24］。由于模擬體系本身的變化以及擾動生物的存在，因此體系中存在多種影響pH的作用，而體系pH的變化正是這些綜合作用的結果。由于影響因素的復雜性，且不同階段主導因素不同，因此體系（特別是上覆水）的pH是動態變化的。

本研究證實了生物擾動作為重要影響因素之一，對淡水/沉積物體系pH有一定的影響，這種影響又必然會影響體系中重金屬等污染物的遷移轉化。低pH往往使重金屬有更高的移動性和生物可利用性，而高pH會使金屬更容易被固相物質束縛［28］。Atkinson等［29］發現上覆水和沉積物pH 的細微變化往往比體系溶解氧和鹽度等的變化更能影響重金屬的釋放。本模擬研究中，沉積物內部的重金屬可能會有向表層遷移的趨勢，而上覆水中重金屬的濃度可能會隨上覆水pH的變化而呈先下降再上升的趨勢。

3 結論

1）利用改進方法制備了基于鍵合HPTS的、具有2個對pH敏感的激發波長且這2個波長激發的熒光隨pH成相反變化趨勢的平面熒光傳感膜。

2）利用所制備的平面熒光傳感膜，構建了基于平面光極的pH二維分布實時監測系統，建立了利用2個激發波長的熒光相差減來獲取pH分布等值線圖的方法。該方法可以很好地記錄模擬淡水/沉積物體系中pH的時空變化規律。

3）生物擾動存在下淡水/沉積物體系的pH存在動態的空間變化，沉積物自身pH時空變化較小但對上覆水pH有重要影響，上覆水pH存在顯著而復雜的變化。這些變化是多種機制綜合作用的結果，而生物擾動對這些作用均有一定影響。

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