利用微生物解決土壤PVA塑料殘留污染研究

簡介

地膜覆蓋栽培技術(shù)的使用與大力推廣為農(nóng)業(yè)增產(chǎn)做出了巨大貢獻，但在糧食和經(jīng)濟作物產(chǎn)量增加的同時，土壤中大量難以降解的塑料地膜殘余物逐年上升，造成了環(huán)境污染，影響了生態(tài)平衡。大多農(nóng)民使用的地膜厚度薄、強度差、易老化、難回收，非常容易殘留在地里，導(dǎo)致“白色污染”。每年有幾百萬噸的地膜被棄于土壤中，是一個不可忽視的污染源。據(jù)調(diào)查，連續(xù)35年覆膜的土地，其中的廢棄地膜可使小麥減產(chǎn)5%9%，蔬菜減產(chǎn)2%10%，玉米產(chǎn)量下降10%，棉花產(chǎn)量下降10%23%。此外，牛羊誤食殘膜碎片，可導(dǎo)致腸胃功能失調(diào)，嚴重時造成死亡。

調(diào)查結(jié)果引起了我們的震驚和思索：能不能找到合適的方法加速降解農(nóng)田土壤中日益增多的殘留農(nóng)膜呢？我們學(xué)校的科技輔導(dǎo)員幫我們查閱了資料，并介紹了從事微生物研究的科研機構(gòu)和輔導(dǎo)老師，確定了項目的可行性。于是，我們開始了關(guān)于農(nóng)膜降解的研究。

研究過程

技術(shù)路線

研究技術(shù)路線見圖1。

菌源樣品

5份菌源樣品分別采自生活小區(qū)垃圾堆、保定市垃圾處理廠、保定市紡織廠排水溝、保定市區(qū)河流底泥及郊區(qū)農(nóng)田土壤。用采樣鏟采集垃圾、污泥及農(nóng)田地表土壤以下1015cm深處土樣各約100g于牛皮紙袋中，記錄采樣時間、地點等信息并標號，風(fēng)干、過4aUc7sGJCvzyexKZpSD2J4v3hFcjyq9PvCt9OIIFRQlM=0目篩，4℃冰箱放置備用，采樣時間為2010年7月，要求所有樣品在3周內(nèi)處理完畢。

實驗方法

高效PVA（聚乙烯醇）降解菌株的分離篩選。實驗共采集了保定市郊垃圾處理廠、紡織廠排水溝土壤、河流底泥等5個土壤樣品，每個樣品篩選3批，共進行了15批次的馴化與分離。

菌株的種屬鑒定。根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，分為形態(tài)觀察、生理生化實驗和16SrDNA序列分析3方面進行。

高效PVA降解菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化（產(chǎn)芽孢工藝研究）。內(nèi)容包括斜面菌種活化、種子制備、液體培養(yǎng)等。

菌株對PVA的降解效果研究，包括菌株芽孢液制備、搖瓶中的降解實驗、土壤模擬降解實驗等。

實驗結(jié)果與分析 土樣中PVA降解細菌的分離篩選

為了提高篩選效率，采用PVA平板透明圈初篩的方法，經(jīng)初篩共得到8株呈現(xiàn)透明圈亦即具備降解PVA能力的菌株（見圖2），分別為1-16、1-21、2-1、2-2、3-3、3-4、3-9和4-2菌株。

對初篩所得8株菌株進行培養(yǎng)，然后測定各菌株對發(fā)酵液中的PVA降解率。結(jié)果顯示，3-4菌株的降解率最高，48h后達到35.43%。

3-4菌株的種屬鑒定

經(jīng)基因組提取、擴增和序列測定，得到該菌株及相應(yīng)標準菌株的進化距離并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。將3-4菌株的形態(tài)及生理生化特征與《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中相應(yīng)屬、種的有關(guān)性狀相對照，發(fā)現(xiàn)3-4菌株形態(tài)及生理生化特征與解淀粉芽孢桿菌較為一致，因此鑒定菌株3-4為解淀粉芽孢桿菌（液化淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens）。經(jīng)科技查新，國內(nèi)報道中尚未見過該菌株用于PVA降解的報道。

解淀粉芽孢桿菌3-4菌株的產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化

實驗結(jié)果表明，PVA降解菌株的搖瓶培養(yǎng)產(chǎn)芽孢條件為：2%麩皮，0.5%玉米漿，0.05%KH PO ，0.3%ZnCl ，Na HPO·12H O0.4%。最佳的發(fā)酵參數(shù)為pH8.0，種齡14h，裝瓶量50mL/250mL三角瓶，30℃，200r/min。在此優(yōu)化條件下，其芽孢產(chǎn)率可達95%以上，總生物量為2.69×10 CFU。

菌株的降解應(yīng)用效果

搖瓶發(fā)酵降解實驗。在搖瓶降解基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入不同濃度的PVA及一定量菌株芽孢液，30℃、200r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)96h，不同時間測定殘留量繪制降解率曲線見圖3。結(jié)果表明，菌液對搖瓶中添加不同濃度的PVA均有降解效果，在濃度為10mg/mL時降解率最高，在96h時達到72.10%；濃度為25mg/mL時，96h降解率為53.59%；菌液對PVA塑料的降解率要低于對純品PVA的降解，分析可能是由于PVA塑料除含有PVA外還有淀粉基體等其他物質(zhì)，因此降解得相對緩慢。

模擬土壤降解實驗。菌液對土壤中PVA純品的降解實驗結(jié)果見圖4。由圖可知，隨著時間的延長，菌液對土壤中的PVA降解率呈增加趨勢，在降解28天時，土壤中的大部分PVA可被降解。菌液對土壤中PVA塑料的降解實驗結(jié)果表明，菌株的施入量對PVA塑料的降解速率有一定影響，菌液加入量越多降解就越快，達到一定值時降解速率的增加則不再明顯。在菌劑加入為4mL時，28天可將PVA塑料降解63.25%。實驗證實，從微生物方面講，菌液不會引起不良生態(tài)效應(yīng)；菌液對受試土壤理化指標無明顯影響，表明該菌株具有良好的大規(guī)模應(yīng)用前景。

本研究創(chuàng)新點及推廣前景

分離篩選出高效降解PVA的新菌株解淀粉芽孢桿菌3-4。經(jīng)科技查新，該菌應(yīng)用于PVA的微生物降解在國內(nèi)文獻尚未見報道。

首次進行了PVA降解菌株（解淀粉芽孢桿菌3-4菌株）的生產(chǎn)工藝研究。研究結(jié)果為利用微生物菌劑降解殘留PVA農(nóng)膜奠定了前期科學(xué)基礎(chǔ)。經(jīng)科技查新，目前國內(nèi)未見PVA菌劑菌株生產(chǎn)工藝的研究及解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)芽孢條件的研究。

探明了所研制菌液降解PVA及PVA塑料的適用條件和實際降解效果，為PVA環(huán)境污染的微生物修復(fù)奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。

本研究所獲的PVA降解菌株降解效率高，菌液生產(chǎn)工藝完善、成本低廉，降解效果明確。此菌株及其菌液生產(chǎn)和實際降解工藝，在PVA農(nóng)膜污染治理方面有較大的應(yīng)用推廣價值，在其他行業(yè)的含PV污染治理方面也具有廣闊的應(yīng)用前景。

下一步工作設(shè)想

所獲得的供試菌株為自然界的野生菌株，應(yīng)具備較大的產(chǎn)酶及降解活性的提高空間，因此可對其開展產(chǎn)酶特性研究，使其降解潛力得以充分發(fā)揮；還可考慮對其實施誘變、基因工程育種等手段，進一步提高其PVA降解能力。

應(yīng)盡快以小白鼠為供試動物考察菌株安全性，確保菌株的使用安全，不會對環(huán)境產(chǎn)生新的危害。

可進一步研究菌劑的大生產(chǎn)工藝和固定化工藝等，為功能菌株的大規(guī)模應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，并深入研究適合的工藝和設(shè)備，提高其降解效率和其實用性。

進一步考察此菌株在其他PVA污染治理中的應(yīng)用潛力，如對紡織廢水中PVA的降解。

該項目獲得第27屆全國青少年科技創(chuàng)新大賽創(chuàng)新成果競賽項目中學(xué)組環(huán)境科學(xué)一等獎。

專家評語

該項目方法科學(xué)，技術(shù)路線可行，研究具有理論和應(yīng)用價值；研究發(fā)現(xiàn)了降解PVA塑料的新菌株，探明了菌液降解PVA塑料的適用條件和實際降解效果，研究有創(chuàng)新意義。建議今后進一步研究菌種選育和菌株在更大范圍治理PVA污染等方面的科學(xué)問題。