引入易錯PCR和DNA-shuffling技術構建單鏈抗體庫

楊 浩，楊青平，查成喜，韓躍武*

（1.蘭州大學基礎醫學院;2.甘肅省第三人民醫院內分泌科，甘肅蘭州 730000）

引入易錯PCR和DNA-shuffling技術構建單鏈抗體庫

楊 浩1，楊青平2，查成喜1，韓躍武1*

（1.蘭州大學基礎醫學院;2.甘肅省第三人民醫院內分泌科，甘肅蘭州 730000）

目的 引入易錯PCR和DNA-shuffling技術構建高庫容量的單鏈抗體庫。方法 收集不同年齡、性別、健康狀態的人的靜脈血各5 mL，提取單個核細胞總RNA，反轉錄為cDNA，PCR擴增VH和VL基因，應用易錯PCR對VH和VL基因進行突變，同時用DNA-shuffling技術對全長單鏈抗體基因進行體外改組，獲得的分子與T載體連接，轉化E.coliDH5α，選取陽性克隆，經菌落PCR后酶切鑒定抗體庫多樣性，計算分析單鏈抗體庫容量。結果 成功構建了庫容量為4.37×1013的單鏈抗體庫，經酶切鑒定，初步判定抗體庫多樣性良好。結論 引入易錯PCR和DNA-shuffling技術，成功構建了單鏈抗體庫，為后續篩選高親和力抗體奠定了實驗基礎。

易錯PCR;DNA-shuffling;單鏈抗體庫

*通信作者（corresponding author）:hanyuewu730000@163.com

單鏈抗體（single chain Fv，scFv）作為重要的基因工程抗體，是利用基因工程方法將抗體重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL）通過一段約5～25個氨基酸的連接肽（Linker）首尾拼接而形成的重組蛋白，具有很好的應用前景。但是，目前在構建單鏈抗體的過程中，往往因為抗體庫的庫容量不高導致篩選出的抗體的親和力較低，影響抗體的功能［1］。本研究旨在構建高庫容量的單鏈抗體庫，為后續篩選高親和力抗體奠定基礎，也為構建高庫容量核糖體展示單鏈抗體庫提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體、菌株及細胞系:pUCm-T載體（上海生工生物工程技術服務有限公司），大腸桿菌E.coliDH5α（華美生物工程公司），基因型 SupE44△lacμ169（80lacZ △M15）hsdR17recAgyrA96thirelAl。

1.1.2 酶類和生化試劑:質粒抽提試劑盒、dNTP、限制性內切酶BstNI、DNaseI等（上海生工生物工程技術服務有限公司），Trizol試劑、快速DNA連接及轉化試劑盒［寶生物工程（大連）有限公司］。

1.1.3 PCR引物設計:引物設計參考V-base（http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/）通用引物及文獻［2］，用Primer Premer5.0加以適當修改，引物合成由上海生工完成。連接肽引物:正向:5'-TCAGGTG GAGGCGGTTCTGGCGGAGGTGGCTCAGGCGGTGGA GGCTCG-3'，反向:5'-CGAGCCTCCACCGCCTGAGC CACCTCCGCCAGAACCGCCTCCACCTGA-3'，scFv 單鏈抗體引物:Cκ上游引物:5'-ACTGTGGCTGCACCA TCTG-3'，Cκ下游引物:5'-ACACTCTCCCCTGTTGAA GCT-3'，scFvf:5'-ATCGACGCTATCGCGGCCCAGCC GGCCCAGGT-3'，scFvD:5'-GCTCAGAACACTCTCCC CTGTTGAAGCT-3'，scFvU:5'-GCAGCTAATACGACT CACTATAGGAACAGACCACCATGGTCGACGCTATC GCGGCCCAGCCGGCCCAGGT-3'，易錯PCR引物 VHep上游引物:5'-ATCGACGCTATCGCGGCCCAGCC GGCCCAGGT-3'，VHep 下游引物:5'-TCCGCCAGAA CCGCCTCCACCTGACTCGCACAGTAATACACGGC-3'，Vκep上游引物:5'-GGTGGCTCAGGCGGTGGAGGC TC-3'，Vκep 下游引物:5'-CAGATGGTGCAGCCACA GTCAGGCTGCTGATTGTGAGAG-3'，Vλep 上游引物:5'-G GTGGCTCAGGCGGTGGAGGCTC-3'，Vλep 下游引物:5'-CAGATGGTGCAGCCACAGTACCTAGGACG GTGACCTTGGTCCC-3'。

1.2 方法

1.2.1 人外周血淋巴細胞的分離與總RNA的提取:收集不同年齡組、不同性別及不同健康狀態的人的靜脈血各5 mL，用淋巴細胞分離液分離外周血淋巴細胞。PBS洗滌分離后的外周血淋巴細胞，計數，參照Trizol試劑使用說明，按108cells/mL Trizol的比例，提取人外周血淋巴細胞總RNA。提取后的總RNA用DEPC處理過的去離子水溶解，經過1.5%瓊脂糖凝膠電泳判斷RNA完整性，測定濃度，用于反轉錄。

1.2.2 人VH、VL和Cκ基因的擴增:以總RNA為模板，Oligo（dT）15為引物，在反轉錄酶作用下反轉錄合成cDNA第1條鏈。以cDNA第1鏈為模板，以不同亞型的重鏈及輕鏈的引物分別擴增人重鏈和輕鏈可變區基因。以Cκ引物擴增人恒定區基因。VH、Vκ擴增條件為:預變性94℃ 5 min;變性94℃30 s，退火69℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，共30個循環;延伸72℃ 10 min。Vλ擴增條件為:預變性94℃5 min;變性94℃ 30 s，退火66℃ 30 s，延伸72℃30 s，共30個循環;延伸72℃ 10 min。Cκ擴增條件為:預變性94℃ 5 min;變性94℃ 30 s，退火43℃30 s，延伸72℃ 30 s，共 30 個循環;延伸72℃10 min。將PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的片段。

1.2.3 VH和VL的易錯PCR:取適量VH和VL進行易錯 PCR。PCR 反應體系為50 μL，包括20 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，5 U/L的 Taq 酶0.5 μL，10 ×易錯 PCR 緩沖液（mmol/L:Tris-HCl（pH 7.4）100、KCl 500、MgCl260、MnCl20.5，0.1%（w/v）明膠）5 μL，10 × 易錯 PCR dNTPs（mmol/L:dATP 2、dGTP 2、dCTP 10、dTTP 10）5 μL。擴增條件同上。

1.2.4 DNA-shuffling:采用重疊延伸 PCR［3］獲得全長單鏈抗體后，對單鏈抗體進行體外改組實驗。

1）DNaseⅠ消化改組模板

取3 μg單鏈抗體做為改組模板，于100 μL反應體系中進行碎片化處理。體系中含50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）、1 mmol/L MgCl2、0.3 U DNaseⅠ。然后16℃ 反應15 min，100℃ 水浴加熱10 min，使DNaseⅠ失活，降解片段經2%瓊脂糖凝膠電泳，回收50～100 bp片段。

2）無引物PCR

將得到的小片段產物進行無引物PCR，反應體系為20 μL，體系中含 mmol/L:KCl 50、Tris-HCl 10（pH 9.0）、MgCl21.5，200 μmol/L 4 種 dNTP 和3 U Taq DNA聚合酶。PCR擴增條件為:預變性94℃3 min;變性94℃ 30 s，退火42℃ 30 s，延伸72℃30 s，共55個循環;延伸72℃ 10 min。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

3）有引物PCR

取5 L無引物PCR獲得的產物，在上述相同的反應體系中，用引物scFvU和scFvD進行PCR反應。擴增條件為預變性94℃ 3 min;變性94℃1 min，退火60℃ 1 min，延伸72℃ 1 min，共 30個循環;延伸72℃ 10 min。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.5 單鏈抗體文庫的構建:用CaCl2法制備大腸桿菌DH5α感受態細胞，利用快速DNA連接及轉化試劑盒做DNA連接及轉化。37℃過夜培養，經藍白篩選，獲得陽性克隆。

1.2.6 抗體庫庫容量及多樣性分析:隨機挑取6個陽性菌落分別放在含有20 μL 0.1%Triton X-100的離心管中，100℃、2 min水浴后，用引物 scFvU和scFvD進行PCR反應，條件同前，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測相應擴增條帶。測定實驗中獲得的單鏈抗體的濃度，參照文獻［4］計算抗體庫庫容量。隨機挑取的6個陽性菌落PCR擴增scFv基因片段經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后進行切膠回收，用BstNI酶切scFv基因片段，4%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切指紋圖譜，分析scFv基因片段多樣性。

2 結果

2.1 總RNA的提取

經1%瓊脂糖凝膠電泳后可見5 S、18 S和28 S 3條清晰條帶（圖1），總RNA質量較好。

圖1 人外周血單個核細胞總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig 1 Electrophoresis of total RNA from human peripheral blood mononuclear cells

2.2 人VH、VL和Cκ基因的擴增

經過PCR擴增，最終得到了長度為335 bp的5個家族的VH基因片段、長度為300 bp的10個家族的VL基因片段（5個Vκ家族基因和5個Vλ家族基因）以及作為單鏈抗體間隔區的長度為320 bp的Cκ基因片段（圖2）。

2.3 VH和VL的易錯PCR

將VH和VL基因經過易錯PCR擴增，得到了長度為335 bp VH基因片段、長度為300 bp的VL基因片段（圖3）。

2.4 DNA-shuffling

圖2 PCR擴增VH、VL和Cκ基因的瓊脂糖凝膠電泳結果Fig 2 Electrophoresis of VH，VL and Cκgenes amplified by PCR

圖3 易錯PCR擴增的人VH和VL基因凝膠電泳圖Fig 3 Electrophoresis of VH and VL genes amplified by error-prone PCR

D NaseⅠ消化改組模板，獲得大小在50～100 bp的DNA片段（圖4），隨后采用不加引物的PCR擴增，經過多次擴增后當序列的長度接近目的基因的長度時，進行有引物擴增，獲得長度約為1 000 bp的scFv基因（圖5）。

2.5 單鏈抗體文庫的構建

隨機挑取6個陽性菌落進行菌落PCR，6個菌落都獲得了長度約為1 000 bp的 scFv基因片段（圖6）。

圖6 菌落PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig 6 Electrophoresis of products with colony PCR

2.6 抗體庫庫容量及多樣性分析

本實驗共獲得scFv基因產物48.9 μg，長度為1 018 bp，經計算，單鏈抗體庫的庫容量為4.37×1013。挑取的6個單菌落scFv基因經BstNI酶切后得到的片段存在很大差異性（圖7），初步分析該單鏈抗體庫多樣性良好。

圖7 BstNI酶切產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig 7 Electropherogram of products with BstNI digested

3 討論

近年來，治療性抗體顯示出越來越廣闊的應用前景，但由于抗體種屬間的差異使其應用受到了很大限制，抗體庫技術的出現為這一問題的解決提供了一條新的途徑，為各種不同免疫原包括自身抗原的抗體獲得提供了一條有效的途徑［5］。然而抗體庫庫容不高一直是單鏈抗體技術需要解決的問題之一。本實驗中，我們利用易錯PCR策略來創造突變體基因，易錯PCR是目前應用較多的隨機突變技術之一［6］，該技術是一種相對簡單、快速廉價的隨機突變方法。通過改變PCR反應條件，使擴增的基因出現堿基錯配，從而導致目的基因的隨機突變。易錯PCR突變基因為接下來的DNA-shuffling提供了豐富的差異基因。DNA-shuffling是基因在分子水平上進行重組。通過改變單個基因（或基因家族）原有的核苷酸序列，創造新基因，并賦予表達產物以新功能。現階段該技術以無以倫比的優越性已發展成為比較普遍的研究核酸和蛋白質體外定向分子進化的一種強有力的技術［7］，已成功的用于工業用酶、抗體等多種重要蛋白質的定向改造，使蛋白質的酶活性、底物特異性及抗體親和性、蛋白功能、熱穩定性等得到顯著提高［8］。本實驗利用易錯PCR獲得的突變基因，再結合抗體基因家族進行改組，大大提高了體外進化的效率以及基因的多樣性。為大容量人源抗體庫的構建提供了良好的解決方案。成功獲得的單鏈抗體庫，為后續篩選得到高親和力抗體奠定了基礎。

［1］Meares CF.The chemistry of irreversible capture［J］.Adv Drug Deliv Rev，2008，60:1383－1388.

［2］Lennard S.Standard protocols for the construction of scFv libraries［J］.Methods Mol Biol，2002，178:59 －71.

［3］王溪橋，韓躍武，楊浩.大容量人源肝癌核糖體展示單鏈抗體庫的構建［J］.亞太傳統醫藥，2010，6:11 －13.

［4］He M，Cooley N，Jackson A，et al.Production of human single chain antibodies by ribosome display［J］.Methods Mol Biol，2004，248:177 －189.

［5］Christoph EH，Constontin VZM，Dominik VE，et al.Single-chain antibodies as diagnostic tools and therapeutic agents［J］.Thromb Haemost，2009，101:1012 －1019.

［6］Minowa N，Akiyama Y，Hiraiwa Y.et al.Synthesis and antibacterial activity of novel neamine derivatives［J］.Bioorg Med Chem Lett，2006，16:6351 －6354.

［7］Makalowski W.Genomics:Not junk after of all［J］.Science，2003，300:1246－1247.

［8］Patten PA，Howard RJ，Stemmer WP.Applications of DNA shuffling to pharmaceuticals and vaccines［J］.Curr Opin Biotechnol，1997，8:724－733.

The introduction of error-prone PCR and DNA-shuffling technology to build mono-chain antibody library

YANG Hao1，YANG Qing-ping2，ZHA Cheng-xi1，HAN Yue-wu1*

（1.School of Basic Medical Sciences，Lanzhou University;2.Endocrine Branch，the Third People's Hospital of Gansu，Lanzhou 730000，China）

ObjectiveTo construct a mono-storage capacity single-chain antibody（scFv）library using error-prone PCR and DNA-shuffling technologies.MethodsPeripheral blood was collected from different age，gender and healthy people.Total RNA was extracted from human peripheral blood mononuclear cells and reversely transcribed to cDNA by RT-PCR.VH and VL genes were amplified by PCR and mutated by error-prone PCR.The full-length ScFv fragments were recombinated with the DNA-shuffling technologyin vitro，and then connected with T vector and transformed intoE.coliDH5α.Antibody library diversity was identified by restriction enzyme digestion after colony PCR，and then the capacity of scFv was calculated.ResultsThe 4.37×1013capacity and better diversity ScFv library was constructed by error-prone PCR and DNA-shuffling techniques.ConclusionsThe scFv library with high-storage capacity and genetic diversity has been constructed，which laid a foundation of selection high-affinity antibodies.

error-prone PCR;DNA-shuffling;scFv library

R 392.11

A

1001-6325（2012）01-0056-05

2011－01－07

2011－07－29