全反式維甲酸對非小細胞肺癌侵襲轉移的干預作用

doi：10.3969/j.issn.1007-614x.2013.21.1

摘 要 目的：采用肺癌H460細胞三維立體培養技術，直接觀察全反式維甲酸對肺的主要成分之一膠原組織降解的干預作用。方法：在肺癌H460細胞三維立體培養過程中加入細胞因子（TNF-α和IL-1β）來誘導MMPs的表達，同時加入RA干預MMPs的表達；用明膠酶譜法測定MMP-2、MMP-9，同時在培養5天后測定膠原含量大小。結果：TNF-α和IL-1β誘導培養在立體膠原內的肺癌H460細胞產生大量MMP-2和MMP-9，并促進其的活化，引起大量膠原降解（P<0.05），RA抑制了MMP-2及MMP-9的表達及活化，進而抑制了膠原的降解，對抗了細胞因子（TNF-α和IL-1β）對膠原的降解作用。結論：炎性介質（TNF-α和IL-1β）可促進MMPs的表達，肺內的膠原可以被基質金屬蛋白酶分解，這一作用可以使肺癌的侵襲或轉移能力得到加強；全反式維甲酸（ATRA）通過抑制MMPs的表達與活化對抗MMPs對肺組織的破壞作用，進而抑制了肺癌的侵襲與轉移。

關鍵詞 全反式維甲酸 基質金屬蛋白酶三維立體培養 細胞因子 TNF-α IL-1β 非小細胞肺癌 肺癌H460細胞

最為最常見的惡性腫瘤之一，肺癌較易轉移并且其轉移過程復雜而連續，嚴重威脅人民健康和生命。影響肺癌轉移的因素有很多，如癌細胞侵襲性、粘附力、基質降解、間質重構、腫瘤血管生成、微環境改變等諸多因素緊密相連。肺癌患者的死亡大多是由于其向遠處臟器的轉移。基質金屬蛋白酶（MMPs）中與肺癌的侵襲或轉移關系最為密切的要屬MMP-2和MMP-9，它們可以使基膜Ⅳ型膠原分解。研究表明，炎癥介質在腫瘤的發生發展過程中起著重要作用，其分泌的細胞因子（TNF-α和IL-1β等）能夠促進體外多種細胞中MMPs的表達已被很多研究證實[1]。但細胞因子對肺癌細胞的研究較少，國內尚未見相關報道，且其作用機制仍不明。既往研究發現，全反式維甲酸（ATRA）具有抑制癌細胞增殖、誘導細胞分化的功能，近年來，針對此方面的研究發現，ATRA還可以對細胞的侵襲能力、運動性以及粘附性等造成一定的影響，這主要是通過其具有調節波形蛋白、粘附分子的能力等來轉移相關蛋白[2，3]，這種能夠抑制轉移的作用有望在未來得到廣泛應用。本實驗旨在觀察肺癌H460細胞在活性膠原的三維立體培養中，與肺損害相關性最強的細胞因子：TNF-α（腫瘤壞死因子）和IL-1β（白介素-1β）對MMPs的誘導作用以及ATRA對膠原降解的干預作用，進而探討它們在非小細胞肺癌侵襲轉移中所起的作用，有望發現將ATRA應用在對人類肺癌進行治療和預防的理論依據。

資料與方法

材料：CO2培養箱、倒置顯微鏡、培養瓶和24孔培養板、電泳系統、蛋白質Marker、 DMEM培養基和胰酶、新生牛血清。由中國人民解放軍總醫院惠贈的非小細胞肺癌H460細胞株。TNF-α、IL-1β、全反式維甲酸（Sigma），DMEM（含10%新生牛血清）培養基中進行細胞均培養，條件37℃、50ml/L CO2，所用細胞均處于對數生長期。

方法：①制備膠原：從截取下來的大鼠整條尾巴中分離出膠原絲，將分離得到的膠原絲用平衡液及乙醇多次漂洗，準備工作完成后，在4℃濃度0.4mmol/L乙酸環境下進行膠原提取[4]。②立體培養細胞：將膠原、4×DMEM和滅菌水按照一定的比例進行混合均勻，形成等滲、等離子、1×DMEM的液體膠原，膠原濃度0.75g/L。肺癌H460細胞濃度4×108/L，以0.5ml/孔移入24孔培養板內，膠原固化后每孔加入DMEM培養液1ml，在37℃，50ml/L CO2條件下培養5天。本實驗共分兩大實驗組：RA干預組與非干預組，RA非干預組又分為對照組A1（Con）、細胞因子（TNF-α）組B1、細胞因子（IL-1β）組C1和細胞因子（TNF-α+IL-1β）D1；RA干預組分為（Con+RA組）A2、（細胞因子TNF-α+RA）組B2、（細胞因子IL-1β+RA）組C2和（細胞因子TNF-α+IL-1β+RA）D1。每小組各設5個平行空。為觀察MMP誘導和活化，在除對照組外的各實驗組培養液中加入TNF-α（10μg/L）和IL-1β（5μg/L），在D1、D2兩實驗組中分別加入TNF-α（10μg/L）和IL-1β（5μg/L）；在ATRA干預組中均加入全反式維甲酸（1μM/L），觀察在ATRA、胞因子干預與非干預情況下兩者對膠原降解的干預作用。培養5天后，收集培養液和膠原。應用羥脯氨酸法來檢測膠原的濃度。培養液中MMP-2和MMP-9應用明膠酶譜法來進行檢測。

統計學處理：重復實驗3次以上。數據來自于1次隨機實驗的結果，為5個培養膠原的（x±s）。運用t檢驗進行兩組間定量資料的比較，進行多組間定量資料的比較使用方差分析。

結 果

如圖1、圖2明膠酶譜所示84kD為MMP-9；72kD為proMMP-2 （MMP-2酶原形式），66kD為其活化式。酶譜圖1顯示肺癌H460細胞在無任何干預情況下可產生proMMP-2（MMP-2酶原形式），但無MMP-9、MMP-2表達（如A1）；在細胞因子（TNF-α和IL-1β）分別作用下，proMMP-2表達增強，并出現MMP-2、MMP-9的表達（如圖B1、C1），同時，當兩種細胞因子共同作用時（如圖D1），proMMP-2、MMP-2、MMP-9表達均增強。酶譜圖2顯示在全反式維甲酸（ATRA）干預下，各實驗組（Con、CM）關于proMMP-2、MMP-2、MMP-9的表達均減弱。以上分析預示細胞因子（TNF-α和IL-1β）在肺癌H460細胞的三維立體培養中促進MMP-2、MMP-9的表達及活化，而RA抑制了細胞因子促進MMP-2、MMP-9表達及活化的效應。

膠原含量（μg/gel）變化：圖3所示，肺癌H460細胞在膠原內立體培養5天后，在無細胞因子CM（TNF-α和IL-1β）及RA干預情況下即可出現少量膠原降解（A1：對照），膠原含量（μg/gel）35.56±1.38；在肺癌H460細胞在立體培養過程中分別在細胞因子TNF-α（B1）、IL-1β（C1）作用下，膠原含量分別為18.72±0.97、19.12±1.21，膠原含量明顯減少，與無細胞因子干預時（A1）存在明顯差異（P<0.05），而B1與C1見未見明顯差異；當細胞因子（TNF-α和IL-1β）共同作用時（D1），膠原含量12.4±1.17，膠原含量較A1、B1、C1時膠原含量進一步減少，并存在明顯差異（P<0.05）。

在RA及CM共同干預時，如圖所示（CM+RA），A2（Con+RA）組膠原含量42.98±1.28，B2（TNF-α+RA）膠原含量35.92±0.88，C2（IL-1β+RA）膠原含量35.84±0.75，D2（TNF-α+IL-1β+RA）膠原含量31.32±0.60；A2、B2、C2、D2各組分別與A1、B1、C1、D1各組差異存在統計學意義（P<0.05），而B2、C2兩組差異無統計學意義（P>0.05）。

以上分析提示細胞因子促進肺癌H460細胞關于MMPs的表達，進而促進膠原的降解，而全反式維甲酸（ATRA）對膠原的降解抑制效果顯著（P>0.05），與此同時，它還可以使由于炎性介質導致的膠原降解速度減慢。

討 論

肺癌的侵襲與轉移是按照一個極其復雜的順序發展的連續過程，我們只要針對肺癌侵襲和轉移過程中的任何一個步驟進行適當的干預或是阻斷其發展，都能夠使癌細胞的轉移終止在該極端不再繼續發展。特異性抗轉移藥物是腫瘤研究的重點和熱點之一。維甲酸類藥物包括了維生素A的天然以及人工合成的衍生物，在對于生長發育的維持方面作用非常重大，這一作用主要表現在它不僅能夠促進上皮組織的分化生長還可以維持其正常的功能。ATRA屬第三代維甲酸，Lokshin A等的研究表明其可以誘導細胞的分化和凋亡，同時還能夠抑制其增殖[5]，通過此次研究我們也發現ATRA除了以上功能以外還能夠抑制肺癌轉移。ATRA抑制轉移的機制是通過減少血管生成來實現，因為ATRA可以明顯抑制血管平滑肌細胞增殖，下調TGF-β基因表達，降低血纖維蛋白酶原激活物的活性，使血纖維蛋白酶原激活物抑制物PAI-1表達上調[6，7]。在Kusmartsev S等的研究結果顯示[8]，ATRA與鼠肝臟星狀細胞聯合作用，可顯著降低原膠原降解，降低腫瘤細胞的轉移。

本試驗采用肺癌H460細胞三維立體培養技術，對細胞以及細胞基質和細胞外基質的降解這三者之間的關系進行直接的觀察，為細胞外間質組織降解破壞和組織重塑建立了理想的體外模型。

本研究表明，肺癌H460細胞單獨在三維立體培養過程中自身可產生少量MMP-2，多為酶原形式（proMMP-2），無明顯膠原降解；當細胞因子（TNF-α或IL-1β）分別或共同干預三維立體培養時，肺癌H460細胞產生了大量的MMP-2、MMP-9，并誘導其活化，此時膠原被大量分解，進而促進了肺癌的侵襲與轉移；而RA明顯抑制了肺癌H460細胞關于MMPS的表達及活化，削弱了細胞因子對膠原的降解作用，進而對肺癌的侵襲與轉移起到抑制作用。在本實驗中預示細胞因子可通過誘導肺癌細胞關于基質金屬蛋白酶（MMPs）的表達及活化，進而促進膠原的降解，最終促進了肺癌的侵襲與轉移，而全反式維甲酸卻削弱了炎性介質的這種作用，進而抑制了肺癌的侵襲與轉移。但這種促進或抑制肺癌侵襲與轉移的機制仍需進一步研究。

參考文獻

1 Zhu YK，Sko ld CM，L iu XD，et al.Fibroblasts and monocyte macrophages contract and degrade three- dimension al collagen gels inextended co-culture[J].Respiratory Res，2001，2（5）：295-299.

2 Y oonWH，Song IS，Lee BH，et al.Differential regulation of vimentin mRNA by 12-O-tetradecanoylphorbol 13-etate and alltrans-retinoic acid correlatesw ithm otility of Hep 3B hum an h epatocellular carcinoma cells[J].Cancer Lett，2004，203（1）：99-105.

3 Wu Q，Chen YQ，Chen ZM，et al.Effects of retinoic acid onm etastasis and its related proteins in gastric cancer cells in vivo and in vitro[J].Acta Pharmacol S in，2002，23（9）：835-841.

4 Mio TY，Adachi DJ，Romberger RF，et al.Regulation of fibroblast proliferation in three dimensional collagen gel matrix[J].In Vitro Cell Dev Biol，1996，32（7）：427-433.

5 Lokshin A，Zhang H，Mayotte J，et al.Early effects of retinoic acid on proliferation，differentiation and apoptosis in nonsmall cell lung cancer cell lines[J].Anticancer Res，1999，19：5251-5254.

6 Watanabe A，Kanai H，Arai M，et al.Retinoids induce the PAI-1 gene expression through tyrosine kinase- dependent pathways in vascular smoot h muscle cells[J].J Cardiovasc Pharmacol，2002，39（4）：503-512.

7 Johst U，Bet SA，Wiskirchen J，et al.All-Trans and 9-cis retinoid acids inhibit proliferation，migration，and synt hesis of extracellular matrix of human vascular smooth muscle cells by inducing differentiation[J].J Cardiovasc Pharmacol，2003，41（4）：526-535.

8 Kusmartsev S，Cheng F，Yu B，et al.All-trans-retinoic acid eliminates immature myeloid cells from tumor-bearing mice and Improves the effect of vaccination[J].Cancer Res，2003，63（15）：4441-4449.