超聲波在山核桃果殼黃酮提取中的應(yīng)用

摘 要：山核桃果殼作為一種農(nóng)業(yè)廢棄物沒有得到充分利用，其中含有包括黃酮在內(nèi)的大量天然活性物質(zhì)。該文通過一系列的單因素和正交試驗(yàn)，得出了使用超聲波提取山核桃果殼中黃酮的最佳提取工藝。

關(guān)鍵詞：山核桃果殼；黃酮；超聲波；提取

中圖分類號 S792 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2013）24-15-03

山核桃是一種落葉喬木，屬胡桃科山核桃屬，其果實(shí)形似核桃而小于核桃，故又稱小核桃。我國是山核桃原產(chǎn)國之一，主要分布在浙江臨安、淳安、安吉、桐廬和安徽寧國、歙縣、績溪等地方，其中以浙江臨安最多[1]。隨著對山核桃需求量的與日劇增，林農(nóng)種植山核桃取仁后遺棄大量的果殼，形成大量的農(nóng)業(yè)廢棄物。常規(guī)的處理只是將果殼焚燒掩埋，會造成土地堿化等污染問題；或者將果殼制成活性炭，其中大量的天然活性成分沒有得到充分利用。

據(jù)研究表明，山核桃果殼中的活性成分有多糖、皂苷、黃酮、強(qiáng)心苷、甾體及三萜、蒽醌、揮發(fā)油、生物堿等各類化學(xué)成分。黃酮類化合物[2]是一類存在于自然界具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)的化合物。它具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化衰老、免疫調(diào)節(jié)等。通過合適的方法提取山核桃果殼中的黃酮成分可以有效利用山核桃果殼的價值。目前常用的提取方法有浸提法、回流提取法、超聲波萃取法等。考慮到成本等因素，常用的提取溶劑是乙醇，由于乙醇的沸點(diǎn)是78℃，回流提取所需的溫度過高，會影響黃酮等天然物質(zhì)的活性，同時能耗增大。超聲波[3]具有振動空化、機(jī)械粉碎和攪拌等作用，可以提高黃酮類化合物在溶劑中的溶解性。同時，超聲波提取具有快速、能耗低、提取率高等優(yōu)點(diǎn)。本研究通過正交試驗(yàn)，探討采用超聲波提取山核桃果殼中黃酮的最佳提取工藝，以期為有效利用山核桃果殼提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 山核桃果殼，購于浙江省臨安市志成炒貨食品廠。洗凈山核桃果殼上的塵土雜物后，在60℃烘干至恒重，用粉碎機(jī)粉碎，過100目篩，儲存于干燥皿中備用。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 多功能電磁攪拌器、超聲波清洗器（可調(diào)溫度、時間）、752型紫外可見分光光光度計，離心機(jī)、電子天平、電子分析天平、循環(huán)水式真空泵、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、粉碎機(jī)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，購于中國藥品生物制品檢定所。95%乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉均為國藥集團(tuán)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)的技術(shù)路線 山核桃果殼洗凈→60℃烘干至恒重→粉碎機(jī)粉碎→過100目篩→將適量樣品和乙醇溶液混合均勻，多功能電磁攪拌器攪拌均勻升至合適溫度→在一定的溫度下超聲波萃取黃酮溶液→離心機(jī)離心，取上清液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至合適體積→測定其中的黃酮含量。

1.2.2 提取方法的確定 黃酮提取的效果主要受到浸提液濃度、料液比、超聲波作用時間、提取溫度等因素的影響。本實(shí)驗(yàn)采用單因素和正交試驗(yàn)結(jié)合的方法確定最適合的提取工藝。

1.2.3 黃酮含量的測定[4] 采用硝酸鋁比色法。常用的檢測方法有分光光度計法和液相色譜法，考慮到實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有條件，采用分光光度計法。黃酮與鋁離子在堿性與亞硝酸存在條件下形成黃酮的鋁絡(luò)生物，呈現(xiàn)穩(wěn)定的黃色。根據(jù)Lamber-beer定律，在一定的范圍內(nèi)，生成的黃色物質(zhì)與黃酮含量呈一定的比例關(guān)系，可以采用蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品作標(biāo)準(zhǔn)，于510nm波長處進(jìn)行比色定量測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 山核桃果殼黃酮提取方法的優(yōu)化

2.1.1 黃酮提取的實(shí)驗(yàn)原理 采用相似相溶的原理，在超聲波的作用下，通過乙醇將在其中溶解度較大的黃酮類物質(zhì)提取出來。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備[5] 準(zhǔn)確稱取經(jīng)105℃恒溫干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品84mg。用50%乙醇溶解，用250mL容量瓶定容，制成標(biāo)準(zhǔn)溶液。用洗液管分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液2mL、4mL、8mL、12mL、16mL于50mL的容量瓶中，用50%乙醇溶液補(bǔ)充至20mL，加入1.4mL亞硝酸鈉（5%）溶液，搖勻放置4min，接著加入1.4mL硝酸鋁（10%）溶液，8min后再加入5mL氫氧化鈉（1mol/L）溶液，搖勻。用50%乙醇定容。分光光度計開機(jī)預(yù)熱20min后于510nm處測定吸光度，試劑為空白參比。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.3 提取液中黃酮含量的測定 用微量取液器吸取提取液2.5mL于50mL容量瓶中，采用上述的測定方法測定提取液的吸光度，測定時需與標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備同時進(jìn)行，以確保條件一致，計算提取率Y。進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。Y=（CxV）/M，其中，C─黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；V─濃縮后的體積，mL；M─提取用山核桃果殼粉末的質(zhì)量，mg；x─稀釋倍數(shù)

2.2 單因素試驗(yàn)及其分析

2.2.1 提取參數(shù)的確定 在其他因素保持穩(wěn)定的情況下，以乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%；料液比分別為1∶5，1∶10，1∶20，1∶40；超聲波作用時間分別為30min、60min、90min、120min；溫度分別為40℃、50℃、60℃、70℃進(jìn)行單因素試驗(yàn)，再根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定本實(shí)驗(yàn)所需的最佳提取條件。

2.2.2 乙醇濃度對提取率的影響 稱取山核桃果殼粉末各4份，每份均為5 000mg（精確到1mg）。分別加入濃度為50%、60%、70%、80%的乙醇100mL，料液比為1∶20，在60℃的恒溫狀態(tài)下超聲波提取90min，冷卻后以4 000r/min離心10min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至合適體積，分別取2.5mL提取液置50mL容量瓶中，然后按照實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行黃酮類化合物的測定。由圖1可知，隨著乙醇濃度的增加，山核桃果殼中黃酮的提取率相應(yīng)增加，但當(dāng)乙醇濃度超過70%的節(jié)點(diǎn)時，黃酮提取率出現(xiàn)下降。其原因主要在于隨著乙醇濃度的進(jìn)一步加大，果殼中其他的醇溶性物質(zhì)析出，和黃酮爭奪與乙醇分子的結(jié)合，影響了黃酮提取率。

圖2 乙醇濃度對黃酮提取率的影響

2.2.3 料液比對提取率的影響 稱取山核桃果殼粉末各4份，每份均為5 000mg（精確到1mg）。分別加入濃度為70%的乙醇25mL、50mL、100mL、200mL，料液比為1∶5、1∶10、1∶20、1∶40；在60℃的恒溫狀態(tài)下超聲波提取90min，冷卻后以4 000r/min離心10min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至合適體積，分別取2.5mL提取液置50mL容量瓶中，然后按照實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行黃酮類化合物的測定。料液比在1∶（5～10）時，隨著乙醇體積的增加，山核桃黃酮的提取率升高。原因在于，當(dāng)樣品量保持不變時，增加乙醇的量可以稀釋樣品粉末附近有效成分的濃度，有利于黃酮向乙醇溶液中擴(kuò)散，有利于有效成分的溶出。料液比為1∶（20～40）時，山核桃黃酮的提取率也在升高，但是升高的幅度較小，變化不明顯。乙醇體積增加到一定程度時，樣品粉末周圍的浸提液濃度趨于飽和。料液比過大時，會造成后期處理工作量加大，造成溶劑和能源的浪費(fèi)，綜合考慮，故選擇1∶20為黃酮提取的最佳料液比。

圖3 料液比對黃酮提取率的影響

2.2.4 超聲波作用時間對提取率的影響 稱取山核桃果殼粉末各4份，每份均為5 000mg（精確到1mg）。分別加入濃度為70%的乙醇100mL，料液比為1∶20，在60℃的恒溫狀態(tài)下超聲波分別提取30min、60min、90min、120min，冷卻后以

4 000r/min離心10min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至合適體積，分別取2.5mL提取液置50mL容量瓶中，然后按照實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行黃酮類化合物的測定。由圖4可見，隨著超聲波作用時間的延長，提取率升高；當(dāng)達(dá)到60min后，黃酮提取率的增長并不明顯；當(dāng)時間達(dá)到120min后，黃酮的提取率反而有所下降。這主要是因?yàn)槌暡ǖ拈L時間作用，破壞了黃酮的分子結(jié)構(gòu)，影響了黃酮的提取率。

圖4 超聲波作用時間對黃酮提取率的影響

2.2.5 溫度對提取率的影響 稱取山核桃果殼粉末各4份，每份均為5 000mg（精確到1mg）。分別加入濃度為70%的乙醇100mL，料液比為1∶20，分別在40℃、50℃、60℃、70℃的恒溫狀態(tài)下超聲波提取90min，冷卻后以4 000r/min離心10min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至合適體積，分別取2.5mL提取液置50mL容量瓶中，然后按照實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行黃酮類化合物的測定。由圖5可知，隨著溫度的提高，黃酮的提取率呈上升趨勢，主要是因?yàn)殡S著溫度的升高，黃酮類物質(zhì)在浸提液中的溶解度提高；同時溫度升高，分子運(yùn)動速度加快，提取液的液體運(yùn)動也相應(yīng)加快，黃酮類化合物更容易從植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)移到浸提溶劑中。在溫度為70℃的情況下，黃酮的提取率升高并不明顯，而且溫度的進(jìn)一步上升還會導(dǎo)致黃酮等天然物質(zhì)活性的破壞，所以選擇60℃為最佳提取溫度。

圖5 提取溫度對黃酮提取率的影響

2.3 山核桃果殼黃酮提取的正交試驗(yàn)設(shè)計及其分析 通過上述單因素試驗(yàn)的結(jié)果，分別以料液比為1∶15、1∶20、1∶25；乙醇濃度為65%、70%、75%；提取溫度為55℃、60℃、65℃；超聲波作用時間分別為40min、60min、80min；進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計，通過軟件生成表1。通過上述的黃酮測定方法測定黃酮含量。對各種條件下山核桃果殼的黃酮提取率進(jìn)行極差分析和方差分析，見表1。通過分析，B因素影響不顯著，故以B因素作為誤差進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2。

表1 正交試驗(yàn)提取結(jié)果及分析

[試驗(yàn)號＼A（料液比）

（g/mL）＼B（乙醇濃度）（%）＼C（提取溫度）（℃）＼D（超聲處理時間）（min）＼提取率

（%）＼1＼1：15＼65＼55＼40＼0.74＼2＼1：15＼70＼60＼60＼0.96＼3＼1：15＼75＼65＼80＼0.85＼4＼1：20＼65＼60＼80＼1.13＼5＼1：20＼70＼65＼40＼0.93＼6＼1：20＼75＼55＼60＼1.21＼7＼1：25＼65＼65＼60＼0.91＼8＼1：25＼70＼55＼80＼0.87＼9＼1：25＼75＼60＼40＼0.79＼K1＼0.850＼0.927＼0.940＼0.820＼＼K2＼1.090＼0.920＼0.960＼1.027＼＼K3＼0.857＼0.950＼0.897＼0.950＼＼R＼0.240＼0.030＼0.063＼0.207＼＼]

從表1和表2可以看出，乙醇濃度和提取溫度對指標(biāo)影響不顯著，料液比和超聲波作用時間對指標(biāo)有顯著性影響（P<0.05）。由極差分析得到，各因素對總黃酮提取率的影響為A>D>C>B，即：料液比>超聲提取時間>提取溫度>乙醇濃度。最佳提取條件為A2B3C1D2，即料液比為1∶20，乙醇濃度為75%，提取溫度為55℃，超聲波作用時間為60min時，所得的黃酮提取率最大。

表2 方差分析

[因素＼偏差平方和＼自由度＼F比＼F臨界值＼顯著性＼A＼0.109＼2＼109.000＼19.000＼*＼B＼0.001＼2＼1.000＼19.000＼＼C＼0.007＼2＼7.000＼19.000＼＼D＼0.061＼2＼61.000＼19.000＼*＼誤差＼0.00＼2＼＼＼＼]

注：*表示在0.05水平上差異顯著。

2.4 回歸實(shí)驗(yàn)結(jié)果 稱取山核桃果殼粉末各3份，每份均為5 000mg（精確到1mg）。在正交試驗(yàn)得出的最佳工藝條件下進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在最佳提取條件下，山核桃果殼黃酮提取率相差不顯著，平均值約為1.28%，具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。該結(jié)果與正交試驗(yàn)分析所獲得的結(jié)果是一致的，說明該正交試驗(yàn)穩(wěn)定有效。

3 總結(jié)

以乙醇作為提取劑，采用超聲波提取，研究山核桃果殼黃酮化合物的最佳提取工藝，結(jié)果表明，影響山核桃果殼黃酮提取效果的主要因素是料液比，其次是超聲波處理時間和提取溫度，乙醇濃度影響最小。采用正交試驗(yàn)優(yōu)化了提取工藝參數(shù)，獲得了最佳提取條件，以較低的溫度和試劑濃度保留了黃酮物質(zhì)的活性，減少了試驗(yàn)次數(shù)，節(jié)約了物料成本和能源消耗。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)確定了最佳提取條件：料液比為1∶20，乙醇濃度為75%，提取溫度為55℃，超聲波作用時間為60min。在此提取條件下，山核桃果殼黃酮提取率為1.28%。

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（責(zé)編：施婷婷）