microRNA作用靶基因的預(yù)測(cè)

摘 要：microRNA（miRNA）是一類約20-25個(gè)核苷酸長的非編碼小分子RNA，廣泛存在于動(dòng)植物細(xì)胞中，通過與靶基因的3′UTR 區(qū)結(jié)合而裂解mRNA 或抑制翻譯的起始。大多數(shù)miRNA 基因以單拷貝、多拷貝或基因簇的形式存在于基因組。它的發(fā)現(xiàn)主要有cDNA 克隆測(cè)序和計(jì)算發(fā)現(xiàn)兩條途徑，目前已證實(shí)miRNA 在生物體生長、發(fā)育和疾病發(fā)生等過程中發(fā)揮著重要的作用。本文主要介紹了miRNA 的特征、miRNA 的功能、作用機(jī)制， miRNA 基因的鑒定和檢測(cè)方法與結(jié)合研究進(jìn)展對(duì)靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。

關(guān)鍵詞：microRNA；靶基因預(yù)測(cè)；生物信息學(xué)；測(cè)序技術(shù)

MicroRNA （miRNA） 是一類內(nèi)生的、長度約為20-25個(gè)核苷酸的單鏈非編碼小RNA。目前的研究表明，微小RNA基因由RNA 聚合酶Ⅱ或Ⅲ所轉(zhuǎn)錄成的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物，在動(dòng)物的身體內(nèi)由剪切酶剪切成長度大概為70個(gè)片段長度的微小RNA 前體，在一些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用之下由細(xì)胞核內(nèi)部轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中，最后經(jīng)過剪切酶的進(jìn)一步切割而產(chǎn)生成熟的微小RNA； 在植物體內(nèi)則由剪切酶逐步剪切為成熟微小RNA，而后經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)輸至核外。成熟的miRNA與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物進(jìn)行結(jié)合，通過和靶基因的信使RNA的一些特定的序列結(jié)合，誘導(dǎo)靶基因的信使RNA 剪切或者抑制它的翻譯。這就是微小RNA的檢測(cè)步驟。對(duì)于細(xì)胞的分化、增殖、凋亡、致癌、抑癌、胰島素等內(nèi)分泌激素的分泌和膽固醇代謝等很多生物過程進(jìn)行調(diào)節(jié)每個(gè)微小RNA可以有很多個(gè)靶基因，而且同一個(gè)基因可以由幾個(gè)微小RNA共同調(diào)節(jié)。miRNA 高度的保守性與微小RNA功能的重要性有密切的關(guān)系。miRNA 與其靶基因的進(jìn)化也有著密切的聯(lián)系，本文研究微小RNA的進(jìn)化歷程有助于研究其功能及作用機(jī)制。

1 miRNA機(jī)制

1.1 miRNA的特征

1.1.1 已經(jīng)被鑒定的miRNAs的顯著特點(diǎn)是前體折疊形成莖環(huán)或類似莖環(huán)的二級(jí)結(jié)構(gòu)[1]。約70個(gè)堿基大小形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈RNA前體經(jīng)過剪切酶加工后生成的。

1.1.2 有5'端磷酸基和3'羥基，大小約20-25nt的小分子RNA片斷，定位于RNA前體的3'端或者5'端。

1.1.3 通過Northern 或?qū)Υ笮》旨?jí)的微小RNA的文庫進(jìn)行克隆的話可以檢測(cè)到20-25片段長度的轉(zhuǎn)錄本；

1.1.4 成熟的微小RNA 由剪切酶加工得到，而隨著剪切酶活性的減弱，我們可以檢測(cè)到的生物體中前體大量積聚。

1.1.5 成熟miRNA的序列在不相同的物種間是保守的。

1.1.6 幾乎所有的微小RNA 都是由前體的其中一條臂而加工得來的。

1.1.7 miRNA以單拷貝形式、多拷貝形式或者基因簇等形式存在于基因組，大部分定位在所編碼基因的內(nèi)含子區(qū)、基因間隔區(qū)或非編碼RNA 的外顯子區(qū)和內(nèi)含子區(qū)。

1.1.8 miRNA 的表達(dá)具有一定的階段性和組織特異性。

1.2 miRNA的功能

通過對(duì)微小RNA前體的基因組定位和注釋發(fā)現(xiàn)，miRNA 主要位于基因間區(qū)或已知轉(zhuǎn)錄本的內(nèi)含子中，占有很大成分的的miRNA 呈現(xiàn)成簇分布的特點(diǎn)。對(duì)miRNA 的深入研究，有利于我們對(duì)生物體生理、病理機(jī)制的理解，并為疾病的診斷和治療以及動(dòng)植物的育種提供理論基礎(chǔ)。盡管目前大部分miRNA 的確切功能以及其發(fā)揮功能的準(zhǔn)確調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚在研究之中，但初步的研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miRNA 在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的調(diào)控功能，如調(diào)控細(xì)胞增殖、脂肪代謝、幼蟲發(fā)育時(shí)序、造血系統(tǒng)分化、生殖干細(xì)胞自我更新和花的發(fā)育。

1.3 miRNA的作用機(jī)制

首先，miRNA 的一切基礎(chǔ)步驟的起始是miRNA前體產(chǎn)生，它由細(xì)胞核內(nèi)編碼微小RNA 的基因通過轉(zhuǎn)錄而生成[2]。科學(xué)家證明這一點(diǎn)，而且其中一些miRNA 的轉(zhuǎn)錄本具有5′帽和3′的結(jié)構(gòu)。

其次，微小RNA前體在核內(nèi)被核酸酶加工成長約70片段的發(fā)夾形狀的微小RNA前體。在這個(gè)過程中，核酸酶和其他的某些成分，構(gòu)成了一個(gè)微小RNA處理器復(fù)合體，miRNA前體在這個(gè)微小RNA處理器復(fù)合體中被制作成了miRNA的前體。

最后，miRNA前體在Ran-GTP 依賴的核質(zhì)或細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作用下，把miRNA前體從核內(nèi)運(yùn)輸?shù)桨|(zhì)中。而能與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合的miRNA前體必須有大于16個(gè)片段長度配對(duì)的莖和3′末端有2個(gè)懸垂堿基的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[3]。然后，微小RNA的前體被剪切酶切成雙鏈配對(duì)分子，成熟的解鏈，單鏈的進(jìn)入微小RNP，通過互補(bǔ)配對(duì)，進(jìn)行切割或者是翻譯。MiRNA的作用是切割還是抑制取決于miRNA 與靶序列互補(bǔ)配對(duì)程度，互補(bǔ)配對(duì)高的有可能進(jìn)行切割，而配對(duì)低的就只能起抑制的作用。

1.4 microRNA 與siRNA 的異同

1.4.1 miRNA 與siRNA 的加工機(jī)制和成熟機(jī)制有很大一部分相同點(diǎn)。

（1）它們都是由22-25個(gè)核苷酸經(jīng)過一系列反應(yīng)而組成的。（2）miRNA和siRNA都是剪切酶Dicer的產(chǎn)物。（3）miRNA 與siRNA 在起干擾或者調(diào)節(jié)作用時(shí)都會(huì)與RISC復(fù)合體結(jié)合，RISC是物質(zhì)基礎(chǔ)。（4）miRNA和siRNA都可以通過干擾來抑制靶基因的翻譯。

1.4.2 從它們的來源、保守性和作用的位置幾方面看，又有很多不同點(diǎn)。

（1）來源上看：微小RNA來源于內(nèi)源轉(zhuǎn)錄本，siRNA來源于轉(zhuǎn)基因、異染色體DNA或者病毒RNA。（2）前體：微小RNA的前體為莖環(huán)狀的pre-miRNA，siRNA是雙鏈結(jié)構(gòu)的dsRNA。（3）每一個(gè)前體產(chǎn)生二聚體的數(shù)目：微小RNA是一個(gè)，siRNA是多個(gè)。（4）催化酶：microRNA 是Drosha酶、Dicer酶或者類似Dicer 的酶復(fù)合體，siRNA是Dicer酶。（5）沉默復(fù)合物中的AGO蛋白：微小RNA所對(duì)應(yīng)的是AGO1，siRNA所對(duì)應(yīng)的是AGO2。（6）匹配方式：對(duì)于微小RNA來說動(dòng)物是不完全互補(bǔ)，植物是完全互補(bǔ)；對(duì)于siRNA來說都是完全互補(bǔ)。（7）對(duì)作用目標(biāo)的專一性：微小RNA相對(duì)較低，siRNA則很高。（8）作用點(diǎn)：蛋白質(zhì)合成水平；轉(zhuǎn)錄后水平。（9）功能：微小RNA發(fā)育過程中，調(diào)節(jié)內(nèi)源性表達(dá)；siRNA抑制轉(zhuǎn)錄活性，病毒感染，表性遺傳。（10）靶基因的命運(yùn)：抑制翻譯或者被降解；siRNA則是只能被降解。（11）作用位置：microRNA主要作用于靶基因3′-UTR 區(qū)；siRNA可作用于mRNA 的任何部位。（12）物種間保守性：microRNA較高，siRNA較低。

2 miRNA 靶基因的鑒定和檢測(cè)方法

根據(jù)預(yù)測(cè)方法的本質(zhì)，計(jì)算預(yù)測(cè)方法可分為五種方法：（1）同源片段搜索方法；（2）基于比較基因組學(xué)的預(yù)測(cè)方法；（3）基于序列和結(jié)構(gòu)特征打分的預(yù)測(cè)方法；（4）結(jié)合作用靶標(biāo)的預(yù)測(cè)方法；（5）基于機(jī)器學(xué)習(xí)的預(yù)測(cè)方法。目前，比較流行的miRNA 靶標(biāo)預(yù)測(cè)算法有TargetScan，miRanda 和PicTar。基于機(jī)器學(xué)習(xí)的miTarget 算法，不完全依賴于人類已有認(rèn)知，但其預(yù)測(cè)性能還有待提高。miRanda、TargetScan和PicTar是目前使用比較廣泛的miRNA靶基因預(yù)測(cè)的算法。

2.1 適用范圍

miRanda適用于脊椎動(dòng)物； DIANA-microT適用于所有哺乳動(dòng)物；RNAhybrid適用于所有哺乳動(dòng)物；TargetScan適用于脊椎動(dòng)物；MicroInspector適用于所有哺乳動(dòng)物；PicTar適用于所有哺乳動(dòng)物；TargetBoost適用于線蟲和果蠅；miTarget適用于所有哺乳動(dòng)物；RNA22適用于所有哺乳動(dòng)物；microTar適用于線蟲、果蠅和小鼠[4]。

第一代預(yù)測(cè)軟件大多都是從種子互補(bǔ)這一規(guī)則出發(fā)來設(shè)計(jì)算法的，其次則是miRNA 靶基因跨物種間保守性；而第二代預(yù)測(cè)軟件則更傾向于機(jī)器學(xué)習(xí)方法訓(xùn)練參數(shù)來進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。

2.2 第1代預(yù)測(cè)軟件

2.2.1 miRanda

miRanda是歷史上第一個(gè)研究出的miRNA靶基因的預(yù)測(cè)軟件[5]。適用范圍很廣泛，不受各種物種的限制。miRanda算法應(yīng)用堿基互補(bǔ)原則：A和T配對(duì)，C和G配對(duì)，A和U配對(duì)。這種方法代替了Smith-Waterman算法，自己構(gòu)建打分的矩陣，而且允許了G=U錯(cuò)配。在熱力學(xué)方面，miRanda利用RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)所構(gòu)成的程序包RNAlib進(jìn)行評(píng)估，評(píng)估m(xù)iRNA的靶基因所構(gòu)成的二聚體的結(jié)合能，而對(duì)于潛在的那些雜交位點(diǎn)，miRanda也進(jìn)行打分。miRanda所用的貪心算法取的那對(duì)是得分最高且自由能是最低的。

2.2.2 DIANA microT

DIANA microT是基于計(jì)算和實(shí)驗(yàn)生物學(xué)方法而開發(fā)出來的miRNA的靶基因預(yù)測(cè)軟件。DIANA microT 考慮到了miRNA能夠調(diào)控單個(gè)靶位點(diǎn)這個(gè)情況。它判別靶基因有以下兩個(gè)依據(jù)：（1）miRNA和靶基因具有很高的親和力，通過結(jié)合能來衡量。（2）影響miRNA和其靶基因形成的miRNA二聚體和相關(guān)蛋白可以指導(dǎo)miRNA和它的靶基因之間的相互作用。（3）RNAhybrid。RNAhybrid是基于miRNA和它的靶基因所形成的二聚體等二級(jí)結(jié)構(gòu)而開發(fā)的miRNA靶基因的預(yù)測(cè)軟件。RNAhybrid允許用戶自定義自由能閾值及p值，也允許用戶自定義設(shè)置雜交位點(diǎn)的偏向。

2.2.3 TargetScan和TargetScans

TargetScan是一款基于靶基因的跨物種保守和miRNA和它的靶基因所構(gòu)成的二聚體的熱力學(xué)特征而開發(fā)出來的哺乳類動(dòng)物靶基因的預(yù)測(cè)軟件。TargetScan第一次引入了假陽性率來評(píng)價(jià)靶基因預(yù)測(cè)的結(jié)果。用信噪比評(píng)價(jià)預(yù)測(cè)出的結(jié)果。

2.2.4 MicroInspector

MicroInspector是可以在線靶基因位點(diǎn)預(yù)測(cè)工具。較為突出的是，本款軟件允許使用者輸入完整mRNA序列或者序列片段，而且允許自定義miRNA和靶基因的二聚體雜交時(shí)的溫度和自由能等參數(shù)，較簡潔，對(duì)初學(xué)者是很好的選擇。

2.3 第2代預(yù)測(cè)軟件

2.3.1 PicTar

PicTar是一款既兼顧上一代許多預(yù)測(cè)軟件的諸多設(shè)計(jì)思想，又采用RNAhybrid法評(píng)估m(xù)iRNA和它的靶基因的二聚體結(jié)合能從而來實(shí)現(xiàn)miRNA的靶基因預(yù)測(cè)。這個(gè)算法一樣強(qiáng)調(diào)了“種子序列”這一序列的關(guān)鍵作用和二聚體的結(jié)合能在靶基因唱的翻譯抑制中起到的關(guān)鍵性作用。然而不同的是，PicTar可以把種子序列分為兩種，分別是“完全匹配種子序列”和“不完全匹配種子序列”。

2.3.2 TargetBoost

TargetBoost是基于GPboost（一種遺傳算法）機(jī)器學(xué)習(xí)的方法，從miRNA和它的靶基因之間相互作用的特征中提煉出來加權(quán)模序來作為參數(shù)，對(duì)于不同種類的miRNA進(jìn)行分類，然后再返回不同的miRNA和它的靶基因之間相互作用的機(jī)率大小概率（scores）作為對(duì)靶基因最終的打分。

2.3.3 miTarget

miTarget則是一款支持向量機(jī)（一種機(jī)器學(xué)習(xí)方法），由于徑向基核函數(shù)對(duì)于miRNA和它的靶基因的二聚體的結(jié)構(gòu)、熱力學(xué)的特征以及miRNA和它的靶基因作用的堿基的位置等參數(shù)來進(jìn)行分類，實(shí)現(xiàn)的一款miRNA靶基因的預(yù)測(cè)軟件。

2.3.4 RNA 22

RNA 22則是以Rfam 3.0中成熟的miRNA作為訓(xùn)練集，利用了Teiresias算法的從中尋找可變的長度模序，訓(xùn)練出一二階馬可夫的模型對(duì)模序進(jìn)行完全的統(tǒng)計(jì)顯著性的過濾，并且對(duì)用3'UTR的序列做過濾后的模序篩選。

2.3.5 micro Tar

Micro Tar是以從miRNA和它的靶基因之間的互補(bǔ)和miRNA 靶基因二聚體的熱力學(xué)穩(wěn)定性來設(shè)計(jì)算法。Micro Tar不要求靶基因跨物種保守。

3 微小RNA對(duì)靶基因的調(diào)控和轉(zhuǎn)錄體的切割

3.1 微小RNA 對(duì)靶基因的調(diào)控

miRNA 對(duì)其靶基因的調(diào)控都是表現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄后水平上，通過對(duì)其靶基因的轉(zhuǎn)錄體所進(jìn)行的切割或者對(duì)其翻譯的抑制的兩種機(jī)制來下調(diào)對(duì)于靶基因的表達(dá)。而這兩種的機(jī)制的選擇取決于它與靶基因轉(zhuǎn)錄體序列互補(bǔ)的程度，如miRNA 與其靶基因轉(zhuǎn)錄體信使RNA能夠充分的互補(bǔ)，miRNA 將通過于切割這種方式來調(diào)控靶基因；如miRNA 與其靶基因轉(zhuǎn)錄體信使RNA不能夠充分的互補(bǔ)，但是有多個(gè)可以進(jìn)行互補(bǔ)的位點(diǎn)，那么miRNA 將通過翻譯抑制的方式來調(diào)控靶基因。在動(dòng)物體內(nèi)，大部分miRNA是不能與靶基因的轉(zhuǎn)錄體完全配對(duì)的，所以被認(rèn)為主要通過翻譯抑制的方式來調(diào)控靶基因。

3.2 微小RNA 對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄體的切割

對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄體的切割是大部分病毒、植物和部分動(dòng)物的微小RNA調(diào)控靶基因的主要方式。miRNA 可以把靶基因信使RNA多次切割并保持所切割的RNA的完整性。而和干擾RNA相似的是，miRNA對(duì)基因的調(diào)控也需要構(gòu)成RISC，RISC所代表的是基礎(chǔ)的部分。RISC 組成的核心成分是miRNA 或siRNA 以及各種蛋白質(zhì)，其中Ago 蛋白是這個(gè)復(fù)合體中的核心蛋白質(zhì)，有著非常重要的作用。不對(duì)稱的miRNA 雙鏈具有選擇性，而這個(gè)選擇性有著很重要的意義，根據(jù)這個(gè)原理可以設(shè)計(jì)出人工miRNA ，使需要的RNA 功能單鏈進(jìn)入RISC 行使干擾功能，提高干擾的效率，避免了微小RNA 的互補(bǔ)鏈對(duì)干擾效果的影響。

4 結(jié)合研究進(jìn)展對(duì)靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)

文章重點(diǎn)講述的是微小RNA特征，功能，作用機(jī)制，以及比較了miRNA和siRNA的相同之處和不同之處。同時(shí)詳細(xì)的講述了miRNA的靶基因的鑒定和檢測(cè)方法，這里著重說的是miRNA的兩代檢測(cè)方法。最后談?wù)摿艘幌耺iRNA對(duì)靶基因的調(diào)控和切割。為此，我在這里對(duì)微小基因?qū)ζ浒谢虻淖饔眠M(jìn)行一下推測(cè)。

我們知道了miRNA 在調(diào)節(jié)不同腫瘤耐藥方面起著非常重要的作用。miRNA 的多態(tài)性及表達(dá)異常可以導(dǎo)致腫瘤耐藥通路的相關(guān)基因表達(dá)水平發(fā)生改變，癌基因和耐藥基因的高表達(dá)、腫瘤細(xì)胞周期的改變等都可以改變腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性。通過分析藥物敏感性細(xì)胞及非敏感性細(xì)胞的miRNA 表達(dá)譜，能夠找到影響藥物敏感性的相關(guān)miRNA，這有利于深入認(rèn)識(shí)腫瘤的耐藥機(jī)制，而且也有助于尋找新的藥物靶標(biāo)及為個(gè)體化用藥提供新的依據(jù)。伴著越來越多參與腫瘤耐藥的miRNA 逐步的發(fā)現(xiàn)以及對(duì)腫瘤耐藥機(jī)制的了解，尤其是miRNA 介導(dǎo)耐藥概念的提出，使對(duì)耐藥性腫瘤個(gè)體化治療重新帶來了曙光。

miRNA 是這幾年以來學(xué)者逐漸加以大量關(guān)注能調(diào)控基因的表達(dá)的重要物質(zhì)，miRNA所調(diào)控的基因大量涉及多種的生物過程，而且微小基因?qū)?xì)胞的表遺傳性也有非常重要的影響。miRNA的表達(dá)譜和它的表達(dá)量的變化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著非常密切的關(guān)系，例如在直腸的腫瘤中發(fā)現(xiàn)miR-143和miR-145的表達(dá)量的下調(diào)；在肺癌中發(fā)現(xiàn)了let-7的表達(dá)量的下調(diào)；在慢性淋巴細(xì)胞性的白血病中發(fā)現(xiàn)了miR-15a和miR-16-1基因的缺失和下調(diào)。miRNA 的調(diào)控機(jī)制所獲得的研究結(jié)果還向我們顯示了，以微小RNA 做底物的RISC對(duì)基因的調(diào)控活性是siRNA的近10倍，而且它還影響了基因表達(dá)并且不需要去改變基因的序列，從此處我們可以推斷，微小RNA在疾病診斷和治療領(lǐng)域具有非常大的利用價(jià)值。我們可以相信，隨著我們對(duì)miRNA 調(diào)控機(jī)制的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和了解，我們會(huì)更清楚地認(rèn)識(shí)到miRNA 的生物學(xué)功能，并且?guī)椭覀兏玫乩眠@種基因調(diào)控物質(zhì)來影響細(xì)胞的表遺傳性，使miRNA 成為戰(zhàn)勝疾病的有力工具。

參考文獻(xiàn)

[1]盛熙暉，杜立新.MicroRNA 及其在人和動(dòng)物上的研究進(jìn)展[J].遺傳，2007，29（6）：651-658.

[2]Kurihara Y，Watanabe Y.Arabidopsis microRNA biogenesis through Dicer-like 1 protein functions[J].Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（34）：12753-12758.

[3]何晨，譚軍，陳薇，等.MicroRNA 研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2006，1：18-25.

[4]周冬根，羅玉萍，李思光.MicroRNA 的結(jié)構(gòu)、生物合成及功能[J].生物技術(shù)通報(bào)，2005，5：20-26.

[5]吳敏，韓召軍.miRNA 研究方法進(jìn)展[J].生物技術(shù)通訊，2005，16（5）： 571-573.