Kiss—1、β—catenin蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中的表達與頸部淋巴結轉移的關系

[摘要] 目的 探討Kiss-1、β-catenin蛋白在甲狀腺乳頭狀癌（PTC）中的表達與頸部淋巴結轉移的關系。 方法 采用免疫組織化學方法檢測86例PTC組織和15例正常甲狀腺組織中Kiss-1、β-catenin蛋白的表達。 結果 ①正常甲狀腺組織的Kiss-1陽性表達率顯著高于PTC（χ2=14.16，P < 0.01）；無伴有頸部淋巴結轉移的PTC的Kiss-1陽性表達率顯著高于伴有淋巴結轉移者（χ2=15.41，P < 0.01）；微小癌與非微小癌兩者的Kiss-1陽性表達率間的差異不具有統(tǒng)計學意義（χ2=3.47，P > 0.05）。②PTC的β-catenin異常表達率顯著高于正常甲狀腺組織（χ2=24.75，P < 0.01）；微小癌和非微小癌、伴有和無伴有頸部淋巴結轉移的PTC間的β-catenin異常表達率的差別均無統(tǒng)計學意義（χ2值分別為0.35和0.53，P > 0.05）。③Kiss-1陰性表達與β-catenin異常表達正相關（spearman correlation value=0.56，P < 0.01）。 結論 β-catenin的異位表達很可能始于PTC發(fā)生發(fā)展過程中的早期階段，Kiss-1表達的下調可能級聯(lián)增強了β-catenin的正向效應作用，最終導致PTC的發(fā)生和頸部淋巴結的癌轉移。

[關鍵詞] 甲狀腺腫瘤；Kiss-1；β-catenin

[中圖分類號] R714.246 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）22-0053-03

Kiss-1[1]是新近發(fā)現(xiàn)的與腫瘤轉移有關的抑制基因，β-catenin降解障礙致使細胞質內游離β-catenin蓄積是Wnt信號轉導通路致癌的關鍵所在[2]。甲狀腺乳頭狀癌（PTC）具有強烈的早期淋巴結轉移傾向，約有1/2患者初診時伴有頸部淋巴結腫大，很多臨床檢查淋巴結陰性的患者其實已存在淋巴結轉移。本實驗旨在分析這兩種腫瘤相關基因在PTC中的表達與頸部淋巴結轉移的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2002年1月～2005年12月福建醫(yī)科大學附屬泉州第一醫(yī)院術后病理確診的86例PTC病例（術前患者均未接受放療或化療）：男21例，女65例，年齡18～86歲，平均38歲，中位年齡33歲，其中微小癌（直徑<1 cm）61例，非微小癌25例；伴有頸部淋巴結癌轉移者40例（A組），不伴轉移者46例（B組），另取結節(jié)性甲狀腺腫或濾泡性腺瘤標本中盡量遠離病變區(qū)的周圍正常甲狀腺組織15例作為對照組（C組）。所有患者的術后切除標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定10～12 h后取材，由全自動脫水機脫水、透明、浸蠟，然后石蠟包埋制成蠟塊，對照HE切片隨機挑取含有較為豐富癌組織的PTC的蠟塊連續(xù)切片，待免疫組化染色備用。

1.2 方法

采用S-P免疫組化法染色。兔抗人Kiss-1單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，工作濃度1∶120。一抗鼠抗人即用型單克隆抗體β-catenin（克隆號：MAB-0259）、通用型Ultrasensitive S-P試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術公司。用PBS緩沖液代替一抗做陰性對照，用已知陽性組織切片做陽性對照，嚴格照試劑盒說明書進行操作。

1.3 結果判斷

由兩位高年資病理醫(yī)師采用雙盲法對免疫組化染色切片進行觀察，Kiss-1以細胞漿內出現(xiàn)棕黃色顆粒沉著為陽性染色，每張切片隨機選取10個高倍視野（×400），根據(jù)文獻[3]報道，分別對其中陽性細胞的比率和染色深度分別進行評估，最后綜合評定，陽性細胞比例計分標準：<10%為1分，10%～50%為2分，>50%為3分；染色強弱計分標準：陰性為0分，淡黃色染色為1分，中度黃色染色為2分，棕褐色染色為3分。二者之積計總分：總分<3分為陰性（圖1），≥3分為陽性。β-catenin主要表達于上皮細胞.細胞接觸側的胞膜上，β-catenin結果判斷參照Mayurama等[4]的方法，分別從細胞膜、細胞質和細胞核判斷β-catenin在細胞內的表達特征，細胞膜β-catenin表達陽性的細胞數(shù)>70%判定為正常表達，反之為表達缺失；細胞質或細胞核β-catenin表達陽性的細胞數(shù)>10%（包括同時細胞膜表達>70%者）判定為異位表達，膜表達缺失或異位表達均稱為異常表達（圖2）。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS13.5軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，采用χ2檢驗，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。相關性分析亦采用χ2檢驗中的相關性檢驗。

2 結果

2.1 正常甲狀腺組織、PTC組織中Kiss-1蛋白的表達

15例正常甲狀腺組織均表達Kiss-1，陽性表達率為100%；86例PTC組織中41例表達Kiss-1，陽性表達率為47.67%，兩者間的差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=14.16，P < 0.01）。25例微小癌中8例表達Kiss-1，陽性表達率為32%；61例非微小癌中33例表達Kiss-1，陽性表達率為54.1%，兩者間的差異不具有統(tǒng)計學意義（χ2=3.47，P > 0.05）。40例伴有頸部淋巴結轉移的PTC（A組）中10例表達Kiss-1，陽性表達率為25%；46例無伴有頸部淋巴結轉移的PTC（B組）中31例表達Kiss-1，陽性表達率為67.39%，兩者間的差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=15.41，P < 0.01）。見表1。

2.2 正常甲狀腺組織、PTC組織中β-catenin蛋白的表達

在正常甲狀腺組織中，β-catenin主要表達于細胞膜，未見異常表達；86例PTC組織中59例異常表達β-catenin，異常表達率為68.60%，兩者間的差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=24.75，P < 0.01）。25例微小癌中16例異常表達β-catenin，異常表達率為64%；61例非微小癌中43例異常表達β-catenin，異常表達率為70.49%，兩者間的差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.35，P > 0.05）。40例伴有頸部淋巴結轉移的PTC（A組）中29例異常表達β-catenin，異常表達率為72.5%；46例無伴有頸部淋巴結轉移的PTC（B組）中30例異常表達β-catenin，異常表達率為65.22%，兩者間的差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.53，P > 0.05）。見表1。

2.3 PTC組織中Kiss-1、β-catenin蛋白表達的關系

45例Kiss-1表達陰性的PTC中，β-catenin異常表達者42例，正常表達者3例；41例Kiss-1表達陽性的PTC中，β-catenin異常表達者17例，正常表達者24例，兩者間的差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=26.80，P < 0.01），而且Kiss-1陰性表達與β-catenin異常表達呈正相關（spearman correlation value=0.56，P < 0.01）。見表2。

3 討論

甲狀腺乳頭狀癌在甲狀腺惡性腫瘤中的發(fā)病率最高，且發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，其臨床特點是易發(fā)生早期淋巴結轉移和局部浸潤，即使在微小癌階段。癌細胞從原發(fā)部位脫落作為浸潤和轉移的首要環(huán)節(jié)，與細胞粘附功能降低密切相關。結合型β-catenin參與細胞間的黏附，它與E鈣黏蛋白形成復合體，再與肌動蛋白的細胞骨架相連，進一步加強細胞之間的緊密連接[5]，本實驗結果顯示PTC的β-catenin異位表達率顯著高于正常的甲狀腺組織，說明PTC癌細胞胞膜結合型β-catenin減少，進入胞漿的游離型β-catenin增多，而后者是APC-β-cat-Tcf4/Lef信號轉導通路中的關鍵分子，它可以通過核膜進入到細胞核內，與DNA親和蛋白Tcf/Lef（T cell factor/lymphoid enhancer factor）結合，激活Wnt途徑靶基因調節(jié)細胞增殖，參與腫瘤形成[6]。但是β-catenin的異位表達率在微小癌和非微小癌、伴有和無伴有頸部淋巴結轉移的PTC組織之間的差異不具有統(tǒng)計學意義，由此可見β-catenin的異位表達很可能始于PTC發(fā)生發(fā)展過程中的早期階段，并且不斷地蓄積于細胞漿、進而累積在細胞核引發(fā)細胞癌變。

腫瘤轉移抑制基因是近年來關注的研究領域，Kiss-1在正常組織中，如心臟、腦、肺、胎盤、睪丸、胰腺、肝臟、腎臟、小腸等組織中都有不同水平的表達[7]，其編碼蛋白可與其受體GPR54結合引起一系列生理生化改變，從而抑制腫瘤轉移[8]。從本實驗結果中發(fā)現(xiàn)PTC組織的Kiss-1陽性表達率顯著低于正常甲狀腺組織，提示PTC的發(fā)生可能與Kiss-1的表達缺失有關；伴有淋巴結轉移者的Kiss-1陽性表達率顯著低于無伴有淋巴結轉移者，提示Kiss-1是影響PTC發(fā)生頸部淋巴結轉移的重要因素。然而Kiss-1陽性表達率在微小癌和非微小癌之間的差異無統(tǒng)計學意義，兩者的Kiss-1的陽性表達率均較低，這亦可成為一個解釋PTC即使在微小癌階段也極易發(fā)生頸部淋巴結轉移原因的實驗依據(jù)。經(jīng)相關性分析得知PTC組織中Kiss-1的陰性表達與β-catenin異常表達正相關，提示Kiss-1表達的下調可能級聯(lián)增強了β-catenin在Wnt信號通路的正向效應作用，隨后引發(fā)一系列的基因突變，最終導致PTC的發(fā)生和頸部淋巴結的癌轉移。

[參考文獻]

[1] Yoshioka K，Ohno Y，Horiguchi Y，et al. Effects of a Kiss-1 peptide， a metastasis suppressor gene， on the invasive ability of renal cell carcinoma cells through a modulation of a matrix metalloproteinase 2 expression[J]. Life Sci，2008，83（9-10）：332-338.

[2] Valbuena A，Vera AM，Oroz J，et al. Mechanical properties of β-catenin revealed by single-molecule experiments[J]. Biophys J，2012， 17，103（8）：1744-1752.

[3] 呂寶軍，王曉鴻，茍新敏，等. Kiss-1、黏蛋白1和上皮鈣黏附蛋白在乳腺癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關系[J]. 中華實驗外科，2011，28（9）：1452-1455.

[4] Maruyama K，Ochiai A，Akimoto S，et al. Cytoplasmic：beta-catenin accumulation as a predictor of hematogenous metastasis in human colorectal cancer[J]. Oncology，2000，59：302-309.

[5] Sun GY，Wu JX，Wu JS，et al. Caveolin-1，E-cadherin and β-catenin in gastric carcinoma，precancerous tissues and chronic non-atrophic gastritis[J]. Chin J Cancer Res，2012，24（1）：23-28.

[6] Gong A，Huang S. FoxM1 and Wnt/β-catenin signaling in glioma stem cells[J]. Cancer Res，2012，15，72（22）：5658-5662.

[7] 楊智. Kiss-1基因在腫瘤中的研究進展[J]. 國際腫瘤學雜志，2010， 37（2）：83-86.

[8] Canbay E，Ergen A，Bugra D，et al. Kisspeptin-54 levels are increased in patients with colorectal cancer[J]. World J Surg，2012，36（9）：2218-2224.

（收稿日期：2013-05-06）