正交實驗優(yōu)選潤肺散結膠囊提取工藝的研究

[摘要] 目的 篩選潤肺散結膠囊的最佳提取工藝。 方法 采用正交實驗設計，以人參皂苷Rb1的含量和水提浸出物得率為考察指標，以加水量、煎煮時間、煎煮次數(shù)為考察因素，優(yōu)選煎煮工藝；以濃縮液相對密度、醇沉濃度、醇沉時間為考察因素，優(yōu)選醇沉工藝。 結果 最佳提取工藝為煎煮3次，第1、2次分別為1.5 h，加8倍量水；第3次1 h，加6倍量水；濃縮液相對密度為1.05，醇沉濃度為60%，醇沉18 h。 結論 該工藝簡便，方法準確可靠，制成品質量穩(wěn)定。

[關鍵詞] 潤肺散結膠囊；正交實驗；煎煮工藝；醇沉工藝

[中圖分類號] R284 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）22-0075-03

潤肺散結膠囊是廣西柳州市中醫(yī)院通過臨床實踐研制出的純中藥制劑，由紅參、海浮石、麥冬、百合、瓜蔞、半夏等14味中藥組成，具有益氣養(yǎng)陰、化痰散結之功效。從2004年7月起，我院腫瘤科、藥學部將潤肺散結湯作為院內協(xié)定方劑已經(jīng)治療肺癌600余例，效果良好。其中系統(tǒng)觀察了潤肺散結膠囊治療氣陰兩虛痰濁泛肺型非小細胞肺癌72例，治療組采用潤肺散結湯口服并加用化療（36例），對照組采用單純化療（36例）。觀察顯示，潤肺散結膠囊合并化療，臨床療效可靠，主癥好轉率治療組（87.15%）明顯高于對照組（64.08%）；生活質量的好轉和穩(wěn)定方面、毒副反應發(fā)生率、完成化療方面，治療組也明顯優(yōu)于對照組[1]。證明潤肺散結膠囊是治療氣陰兩虛、痰濁泛肺型非小細胞肺癌的有效制劑，值得臨床推廣應用。此外，我們還進行了潤肺散結膠囊對Lewis肺癌（荷瘤）小鼠的抑瘤作用實驗。實驗結果表明，潤肺散結膠囊對體外培養(yǎng)的Lewis肺癌細胞有明顯的抑制作用，其機制可能為誘導腫瘤細胞凋亡和提高機體免疫功能[2]，為臨床用藥和本課題的深入研究提供了理論依據(jù)。為了更好地控制其質量，為制備工藝提供科學性依據(jù)，本文以人參皂苷Rb1含量和水提浸出物得率作為提取工藝評價指標，采用正交實驗法對提取工藝進行系統(tǒng)考察，以篩選出最佳工藝。

1 儀器與試藥

DH64型電熱恒溫干燥箱（上海市躍進醫(yī)療器械一廠）；KQ-200VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CAL204電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；KDM可調控溫電熱套（山東鄄城科源儀器設備廠）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；HP-01無油真空泵 （上海市躍進醫(yī)療器械一廠）；LK-1000A型搖擺式高速中藥粉碎機（浙江溫嶺市創(chuàng)力藥材器械廠）；GC2105格力電磁爐（格力電器中山市小家電制造有限公司）。

紅參、鱉甲、瓜蔞（廣西柳州百草堂藥業(yè)有限公司，批號：20110208）；百合、法半夏、麥冬、白英（國藥控股柳州有限公司，批號：20110211）；玄參、靈芝、炙甘草、生地黃、炮山甲（廣西柳州百草堂藥業(yè)有限公司，批號：20110126）；海浮石、生牡蠣（廣西萬豐藥業(yè)有限公司，批號：20110209）。其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 藥材吸水率試驗

按處方比例稱取1/4處方量藥材6份，分別加入10倍量水，放入6個500 mL以上的燒杯中，編號，于不同時間濾出浸泡液，精密稱定吸液后的藥材重量，量取濾液體積，直至全部藥材浸泡過心、吸水量不再增加為止，見表1。

結果表明，吸水率約為藥材重量的146%，故第一次煎煮時應多加1.26 倍量的水。

2.2 煎煮工藝正交實驗設計

結合文獻報道[3，5]，以加水量（A）、煎煮時間（B）、煎煮次數(shù)（C）為主要考察因素，以人參皂苷Rb1含量和水提浸出物得率為考察指標，以兩項指標分別占60和40、總分為100分進行綜合評分，設計每個因素選擇三個水平進行實驗，采用L9（34）正交設計法對提取工藝進行優(yōu)化。煎煮工藝的因素水平見表2；煎煮工藝正交實驗結果見表4；方差分析結果見表5。

2.3 煎煮試驗樣品的制備

將處方中各藥材粉碎成粗粉，按比例稱取適量，根據(jù)表2的安排加水煎煮提取，煎煮前用規(guī)定量水浸泡。煎煮液用四層紗布濾過，合并，濃縮至200 mL，即得9份煎煮液，冷卻置于冰箱，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 人參皂苷Rb1含量測定[6]

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A：0.05%磷酸溶液，流動相B：乙腈，按表3進行梯度洗脫；流速：0.8 mL/min ；檢測波長：203 nm；柱溫：30℃；進樣量：20 μL；理論塔板數(shù)按人參皂苷Rb1色譜峰計算不低于5 000，與相鄰色譜峰的分離度>1.5。

2.4.2 對照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Rb1對照品適量置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成濃度1.020 mg/mL 的人參皂苷Rb1對照品溶液備用。

2.4.3 供試品溶液的制備[7] 取潤肺散結膠囊樣品內容物約10 g，精密稱定，置索氏提取器中，加石油醚（30℃～60℃）100 mL，加熱回流2 h，棄去石油醚，揮干藥渣溶劑，加甲醇提取至無色，合并提取液，水浴蒸干，殘渣加水60 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次40 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇溶解并定量轉移至10 mL量瓶中，加甲醇到刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4.4 陰性對照液的制備 按“2.3 煎煮試驗樣品的制備” 項下方法制備得到一份缺紅參藥材的煎煮液，后按上述 2.4.5 供試品溶液的制備 項下方法同法制備，得到缺紅參的陰性對照液。

2.4.6 樣品測定 取人參皂苷Rb1對照品加甲醇溶解后在200～400 nm波長下掃描，最大吸收峰位置與2010年版中國藥典下相同，均為203 nm。分別吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照液，注入高效液相色譜儀，以外標兩點法計算含量，結果見表3。

2.5 得膏率的測定

分別精密移取10 mL煎煮液，置于已恒重的干燥蒸發(fā)皿中水浴蒸干后，置于105℃烘箱中干燥3 h，迅速置于干燥器放冷，稱重，計算得膏率。

2.6 煎煮工藝優(yōu)選

見表4。

由表3、表4可知，因素C即提取次數(shù)對人參皂苷Rb1含量及得膏率的綜合結果影響有顯著性，因素A和因素B對本試驗體系的影響沒有統(tǒng)計學意義，即加水倍數(shù)和煎煮時間對于試驗結果影響不大。影響程度依次為C>A>B，因而確定最佳煎煮工藝為A2B2C3，即煎煮3次，第1、2次分別為1.5 h，加8倍量水；第3次1 h，加6倍量水。

2.7 醇沉工藝的正交設計

本實驗以濃縮液相對密度（A）、醇沉濃度（B）、靜置時間（C）為主要考察因素，以人參皂苷Rb1含量為考察指標，設計每個因素選擇三個水平進行實驗，采用L9（34）正交設計法對醇沉工藝進行優(yōu)化，醇沉工藝因素水平見表6；醇沉工藝正交實驗結果見表7；方差分析結果見表8。

2.8 醇沉試驗樣品的制備及測定

根據(jù)最佳煎煮工藝制備9份煎煮液，分別濃縮至相對密度（60℃時測）為1.05、1.10、1.15，冷卻后，按照醇沉工藝正交表，邊快速攪拌邊緩慢加入95%的乙醇，使含醇量達到各實驗號所要求的含醇濃度，按要求靜置、抽濾，沉淀用相應濃度乙醇兩倍量體積分兩次沖洗，合并濾液。濾液回收乙醇，濃縮液水浴蒸干，減壓干燥得到干膏，研細。稱取0.5 g干膏，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入50 mL甲醇，稱重，超聲60 min，放冷，補重。濾過，得供試品溶液，按“煎煮工藝正交實驗設計”中“2.4人參皂苷Rb1含量測定”項下測定。

2.9醇沉工藝優(yōu)選

見表6～8。由表7、表8可知，因素A對醇沉工藝的影響顯著，因素B、C基本無影響，影響程度依次為A>B>C，結合直觀分析表結果可以確定最佳醇沉工藝為： A1B2C2，即濃縮液相對密度為1.05，醇沉濃度為60%，靜置時間18 h。

2.10 工藝驗證試驗

取1倍量的處方投料，按照最佳煎煮工藝提取，合并煎煮液。按“2.4.3 供試品溶液的制備”項下制備供試品溶液，測定提取液中人參皂苷Rb1的含量，并測定浸膏得率，實驗數(shù)據(jù)及結果見表9；另取1倍量的處方投料，按照最佳煎煮工藝提取，最佳醇沉工藝處理，按“2.8醇沉試驗樣品的測定”項下自“按要求靜置”同法操作，測定干膏中人參皂苷Rb1的含量，實驗數(shù)據(jù)及結果見表10。由驗證實驗結果可見，按優(yōu)化的條件重復操作3次，煎煮工藝中，人參皂苷Rb1的平均含量為0.667 2 mg/g，平均得膏率為31.00%，人參皂苷Rb1含量的RSD=3.72%，浸膏得率的RSD=2.31%；醇沉工藝中，醇沉后所得干膏中人參皂苷Rb1的含量平均為0.657 6 mg/g，RSD=2.89%，結果均比較理想。表明此煎煮和醇沉方法重現(xiàn)性好，工藝條件合理、穩(wěn)定、可行。

3 討論

在實驗中，考慮到藥材的吸水性，因而對藥材的吸水率進行了考察，通過實驗得出該處方藥材的吸水率為146%，進一步提高了試驗的準確性。

本研究通過正交實驗確立了潤肺散結膠囊提取工藝中的一系列參數(shù)，為工業(yè)化生產(chǎn)條件的制定提供了參考依據(jù)。在研究中發(fā)現(xiàn)不同供應商及產(chǎn)地的藥材含量相差太大，如不同批次購買紅參中人參皂苷Rb1的含量相差數(shù)倍。故本研究中所優(yōu)選最優(yōu)水平的有關指標數(shù)值僅作為制劑工藝篩選依據(jù)，不宜作為制定質量標準的含量參考。

因紅參為方中君藥，人參皂苷Rb1為紅參有效成分之一，在水提工藝中采用高效液相法測定提取物中人參皂苷Rb1的含量，并以此評價工藝的優(yōu)劣，故其為重要指標之一，權重系數(shù)定為0.6。另將得膏率作為大類成分間接控制的指標，考察水提液得膏率量，確定權重系數(shù)為0.4。通過正交試驗，確定了最佳的提取工藝。確定的提取工藝操作簡單，重復性好，提取效率高，在制備潤肺散結膠囊的過程中有較高的應用價值。

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（收稿日期：2013-03-21）