miR—200c在肝細胞癌組織中的表達及其臨床意義

[摘要] 目的 研究miR-200c在肝細胞癌組織中的表達并探討其臨床意義。方法 收集肝細胞癌手術組織標本52例，30例癌旁正常組織作為對照，采用qRT-PCR檢測肝細胞癌組織及對照組織中miR-200c的表達情況，分析miR-200c表達水平與肝細胞癌臨床病理參數之間的關系。結果 肝細胞癌組織中miR-200c平均表達量明顯低于癌旁對照組織，差異具有統計學意義，癌旁對照組織中miR-200c平均表達量約為肝細胞癌的2.90倍。miR-200c的表達水平與肝細胞癌惡性程度、腫瘤分化程度以及AFP表達有關，miR-200c的表達水平與肝細胞癌患者年齡、性別、HBsAg、腫瘤大小、是否合并肝硬化等無關。多元Logistic回歸模型分析發現，腫瘤大（OR=2.44，95%CI：1.22～10.36）、血清AFP 高（OR=2.39，95%CI：1.78～5.34）、腫瘤分化程度低（OR=3.08，95%CI： 2.29～6.03）是肝癌發病的獨立危險因素。結論 miR-200c與肝細胞癌的發生、臨床進展密切相關，它可能是肝細胞癌新的潛在的治療靶點及診斷預后分子標志物。

[關鍵詞] 肝細胞癌；miR-200c；臨床進展

[中圖分類號] R735.7 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）28-0001-03

miRNA 是一種包含21～25 個核苷酸的內源性非編碼小RNA。miRNA由高等生物基因組編碼，通過5’端被稱為種子序列的7 nt序列與位于靶mRNA 3’UTR的 miRNA調控元件相互作用，識別靶mRNA，引導沉默復合體降解mRNA或阻礙其翻譯，從而參與調控個體發育、細胞凋亡、增殖及分化等生命活動[1-4]。研究表明，miR-200c在乳腺癌細胞和乳腺癌干細胞中表達下調[5-6]。miRNA-200c通過抑制ZEB1來增強RASSF1A表達，進而抑制乳腺癌細胞的表皮細胞向間質細胞轉化過程[7]。這些結果提示，miR-200c表達下調可能在腫瘤的發生發展中具有重要作用。但目前miR-200c在肝細胞癌的生物學功能并不清楚。本研究通過qRT-PCR技術檢測miR-200c在肝細胞癌組織與癌旁對照組織中表達情況，并探討miR-200c與肝細胞癌臨床分期、轉移等臨床參數之間的關系，從而為進一步揭示肝細胞癌發病機制和尋找新的診斷及預后分子標志物提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 標本收集

52例肝細胞癌標本均取自于郴州市人民醫院2009年1月～2011年10月肝細胞癌患者手術標本和30例癌旁對照標本（距離癌組織邊緣3cm以外），組織立即置于液氮保存。所有組織標本均經病理學診斷證實為肝細胞癌。手術前未接受化療，且獲得患者知情同意書。

1.2 RNA提取、逆轉錄

常規Trizol試劑抽提總RNA，無酶水溶解沉淀。紫外分光光度計測定RNA提取液的A260及A280吸光度值，檢測RNA純度和濃度。

逆轉錄反應按轉錄miRNA逆轉錄試劑盒（上海吉瑪生物技術有限公司）說明書進行。反應體系：5×RT緩沖液4 μL、1 μmol/L miRNA特異性RT引物1.2 μL、25 mmol/L鎂離子3 μL、10 mmol/L dNTP 0.75 μL、40 U/μL RNA酶抑制劑 0.25 μL、200 U/μL MMLV逆轉錄酶0.2 μL、RNA 1 μg，用無酶水補至20 μL。反應條件：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 10 min。

1.3 定量PCR檢測

采用SYBR方法，應用Biorad公司的定量PCR儀 IQ5進行定量PCR反應。反應體系：2×PCR緩沖液10 μL、5 μmol/L miRNA特異性PCR引物0.4 μL、 RT產物1 μL、5 U/μL Taq酶 0.2 μL、無酶水加至20 μL。反應條件： 95℃3 min，95℃ 12 s、62℃ 35 s，共40個循環。miR-200c的相對表達量通過公式2-△Ct計算，其中，△Ct=miR-200c平均Ct值-U6平均Ct值[5]。

1.4 統計學分析

采用統計軟件SPSS 13.0進行統計學分析，兩組間比較采用t檢驗。miR-200c表達水平與肝細胞癌臨床病理參數進行Logistic回歸分析，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1肝細胞癌組織中miR-200c表達明顯下調

提取52例肝細胞癌組織以及30例癌旁對照組織總RNA，運用qRT-PCR檢測miR-200c肝細胞癌組織及癌旁對照組織中的表達情況，結果顯示，與癌旁對照組織相比，miR-200c在肝細胞癌組織表達普遍下調。肝細胞癌組織中miR-200c平均表達量明顯低于癌旁對照組織，分別為（0.54±0.04）、（1.06±0.06），差異具有統計學意義（P<0.01），肝細胞癌組織miR-200c平均表達量約為癌旁對照組織中的0.51倍。

2.2 miR-200c表達水平與肝細胞癌臨床病理參數之間的關系

如表1所示， miR-200c下調表達程度與肝細胞癌惡性程度、腫瘤分化程度以及AFP有關，miR-200c的表達隨著臨床分期增加而下調，分化程度越差的肝細胞癌組織中的miR-200c的表達越低，差異均有統計學意義（P<0.01）；且miR-200c的表達與AFP相關，AFP表達高的肝細胞癌組織中的miR-200c表達低，差異有統計學意義（P<0.05）；此外，miR-200c的表達水平與肝細胞癌患者年齡、性別、HBsAg、腫瘤大小、是否合并肝硬化等無關，差異均無統計學意義（P>0.05）。

2.3肝癌發病風險的多元Logistic回歸模型

把單因素分析有統計學差異的影響因素納入多元Logistic回歸模型進行分析發現，腫瘤大小（OR=2.44，95%CI： 1.22～10.36）、血清AFP 高（OR=2.39，95%CI：1.78～5.34）、腫瘤分化程度低（OR=3.08，95%CI：2.29～6.03）、TNM 分期高（OR=3.69，95%CI：0.25～0.63）是肝癌發病的獨立危險因素。具體見表2。

3 討論

肝細胞癌是指發生于肝臟的惡性腫瘤，即人們平常所說的肝癌指的多數為原發性肝癌。其死亡率在消化系統惡性腫瘤中，位列第三位，僅次于胃癌和食管癌。我國每年約有11萬人死于肝癌。是此病的高發區，已成為嚴重威脅人民健康的重大疾病，值得我們重視[8]，其患病率占全世界的50%以上。對于肝癌的治療包括手術治療、肝動脈栓塞治療、放射治療、局部治療、全身化療、生物和免疫治療、中醫治療、綜合治療和并發癥的治療等。手術治療是治療肝癌的主要方法，在手術切除或化療、放療殺滅大量癌細胞后，應用生物和免疫治療可鞏固和增強療效，國內外現在多用基因重組細胞因子和細胞因子激活的細胞進行過繼免疫治療。這些都是通過激活體內殺傷細胞起攻擊腫瘤細胞的作用，從而可以延緩腫瘤的進展，延長患者的生存期[9]。導致目前肝癌這種局面的主要原因有三：一是肝癌發病隱匿，早期無任何癥狀，一旦發現，絕大多數患者處于晚期，失去了根治的時機；二是肝癌對現有的化療藥物和放射治療均不太敏感，除了手術和一些物理治療外，可供選擇的有效治療方法有限；三是患者治療（如手術）后復發和肝外轉移率高。因此，腫瘤研究者一直致力于尋找肝癌治療的靶點。

miRNA成為分子生物學研究熱點，人類miRNA充當瘤基因或抑瘤基因的作用調控mRNA的表達及相關信號通路，在腫瘤的發生、發展和轉歸過程中發揮重要作用。研究表明，至少30%以上的蛋白編碼基因受miRNA調節，它廣泛參與了包括細胞增殖、凋亡、分化、早期胚胎發育以及應激反應等生命活動中的重要過程[10，11]，同時，它的表達改變也在腫瘤的發生發展過程中起著十分重要的作用。與編碼蛋白的基因一樣，不編碼的miRNA在疾病發生發展中的生物學行為表現為類似抑制疾病發展的基因樣的作用[12-15]。本文運用qRT-PCR首次檢測miR-200c在肝細胞癌組織中的表達情況，并分析其臨床意義。結果顯示與癌旁對照組織相比，miR-200c在肝細胞癌組織表達明顯下調；miR-200c下調表達程度與肝細胞癌惡性程度、腫瘤分化程度、AFP水平有關，miR-200c的表達隨著臨床分期增加而下調，分化程度越差的肝細胞癌組織中的miR-200c的表達越低，差異均有統計學意義。我們的結果顯示miR-200c在肝細胞癌與癌旁對照組織存在表達差異，其表達水平與患者臨床進展及預后呈負相關，多元Logistic回歸模型進行分析發現，腫瘤大、血清AFP 高、腫瘤分化程度低、TNM 分期高是肝癌發病的獨立危險因素，表明miR-200c可能作為抑癌基因參與肝細胞癌的發生發展，并且可能成為肝細胞癌診斷和預后判斷新一代腫瘤分子標志物及肝細胞癌治療靶點。當然日后仍需大量實驗進行驗證。總之，闡明miR-200c在肝細胞癌發生發展中的作用對于認識肝癌發生的機制，探索新的有效的肝細胞癌診斷預后評價標志物及治療方法，具有重要的科學意義。

[參考文獻]

[1] Tang H，Liu X，Wang Z，et al. Interaction of hsa-miR-381 and glioma suppressor LRRC4 is involved in glioma growth[J]. Brain Res，2011， 1390（1）：21-32.

[2] Wu J，Wu G，Lv L，et al. MicroRNA-34a inhibits migration and invasion of colon cancer cells via targeting to Fra-1[J]. Carcinogenesis，2012，33（3）：519-28.

[3] Liu C，Kelnar K，Liu B，et al. The microRNA miR-34a inhibits prostate cancer stem cells and metastasis by directly repressing CD44[J].Nat Med，2011，17（2）：211-215.

[4] Yang P，Li QJ，Feng Y，et al. TGF-β-miR-34a-CCL22 signaling-induced Treg cell recruitment promotes venous metastases of HBV-positive hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Cell，2012，22（3）：291-303.

[5] Iliopoulos D，Lindahl-Allen M，Polytarchou C，et al. Loss of miR-200 inhibition of Suz12 leads to polycomb-mediated repression required for the formation and maintenance of cancer stem cells[J]. Mol Cell，2010，39（5）：761-772.

[6] Shimono Y，Zabala M，Cho RW，et al. Downregulation of miRNA-200c links breast cancer stem cells with normal stem cells[J]. Cell，2009，138（3）：592-603.

[7] Howe EN，Cochrane DR，Richer JK. Targets of miR-200c mediate suppression of cell motility and anoikis resistance[J]. Breast Cancer Res，2011，13（2）：R45.

[8] 黃軍，謝敖文，李青華，等. 肝細胞癌組織中miR-218的表達及其臨床意義[J]. 醫學臨床研究，2013，30（4）：122-124.

[9] 陸再英，鐘南山. 內科學[M]. 第7版. 北京：人民衛生出版社，2008：457-462.

[10] 周建大，譚建湘，謝慧清，等. 原發性皮膚黑色素瘤的microRNA基因芯片研究[J]. 中國醫師雜志，2010，12（3）：405-406.

[11] 呂輝 唐云云 唐海林，等. miR-124在胃癌中的表達及其臨床意義[J]. 醫學臨床研究，2012，29（3）：388-390.

[12] 唐海林，鄧敏，廖前進，等. miR-23a與轉移抑制因子1在肝癌中的表達及其臨床意義[J]. 中華病理學雜志，2012，41（1）： 28-32.

[13] 唐海林，鄧敏，廖前進，等. 肝癌組織中miR-185的表達及其臨床意義[J]. 中南醫學科學雜志，2011，39（5）：17-18.

[14] Tang H，Bian Y，Tu C，et al. The miR-183/96/182 cluster centralizes to regulate oxidative apoptosis and sensitizes cells to chemotherapy in gliomas[J]. Current Cancer Drug Targets. 2013，13（2）：221-231.

[15] Ma L，Teruya-Feldstein J，Weinberg RA. Tumour invasion and metastasis initiated by microRNA-10b in breast cancer[J]. Nature，2007，449（7163）：682-688.

（收稿日期：2013-06-21）