丹參提取物764—3對高氧損傷后新生大鼠腦細胞凋亡以及血管內皮生長因子表達的影響

[摘要] 目的 探討抗氧化劑丹參提取物764-3對高氧損傷后新生大鼠腦細胞凋亡和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達的影響。 方法 采用Spraque-Dawley（SD）新生大鼠持續暴露于≥90%高氧14 d建立高氧腦損傷模型，分別用764-3進行預防和治療干預后，采用HE染色對比腦細胞病理變化，SABC免疫組化法檢測VEGF表達水平以及脫氧核糖核酸轉移酶介導的細胞凋亡標記法（TUNEL）檢測腦細胞凋亡情況。結果 高氧對照組與空氣對照組相比：可見神經元變性，VEGF表達下降，凋亡指數（apoptosis index，AI）增多。干預組14 d與高氧對照組14 d相比：764-3預防組VEGF表達高于高氧對照組，但差異無顯著性（P>0.05），764-3治療組VEGF表達顯著高于高氧對照組（P<0.05），兩干預組間差異無顯著性（P>0.05）。兩干預組凋亡指數均明顯下降且差異顯著（P<0.01），764-3治療組顯著低于預防組（P<0.01）。結論 764-3可通過上調腦組織中VEGF的表達來抑制腦細胞凋亡從而發揮保護作用。

[關鍵詞] 細胞凋亡；VEGF；高氧癥；腦損傷；丹參提取物

[中圖分類號] R651.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）28-0016-03

隨著NICU的發展，越來越多的超低體重兒得以存活。由于早產，他們的肺極不成熟，使氧療和機械通氣成為必不可少的搶救措施。但高氧復蘇亦可造成新生兒腦損傷，且已逐漸引起重視，然而其發病機制尚未完全明了，一般認為是與氧自由基引起的腦脂質過氧化反應有關。因此研究高氧腦損傷保護劑是國內外一直關注的課題，有效而低毒性的神經保護劑是中西醫共同追求的目標。764-3是中藥抗氧化劑丹參的提取物，具有一個含雙鍵的環狀結構，對組織的氧化損傷有一定的保護作用[1]。本文通過檢測經764-3處理過的高氧損傷后的新生大鼠腦細胞凋亡指數和VEGF的表達水平，以評價764-3在防治高氧腦損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1動物模型及分組

將清潔級SD雌雄大鼠（由溫州醫學院實驗動物中心提供）按3∶1合籠交配，生后6 h內置設定的≥90%高氧艙或空氣艙中（由溫州醫學院動物實驗中心提供），艙內控制溫度25℃～26℃，濕度60%～70%。高氧腦損傷模型的建立參照Felderhoff-mueser U[2]和Peiser C[3]等建立的模型。每天開箱約1 h用于添加飼料及更換墊料，并且讓空氣組和高氧組母鼠每天更換，以防母鼠氧中毒影響哺乳。新生鼠共分為4大組，分別為空氣對照組（Ⅰ組）、高氧對照組（Ⅱ組）、764-3預防組（Ⅲ組）、764-3治療組（Ⅳ組）。Ⅰ組和Ⅱ組為對照組，取7 d和14 d兩個時間點，研究高氧暴露造成腦損傷的時間依從性，Ⅲ組和Ⅳ組為干預組，取14 d一個時間點，研究764-3的預防和治療作用。每小組新生鼠數目調整在8～9只之間，共6小組（空氣對照組7 d， 空氣對照組14 d， 高氧對照組7 d， 高氧對照組14 d，764-3預防組14 d， 764-3治療組14 d）49只新生大鼠。Ⅲ組于生后第1～7 天注射藥物；Ⅳ組于生后第8～14 天注射藥物；每日晨起定時給藥。有學者[2]發現，新生鼠高氧腦損傷的最敏感時期為生后1周以內，故將1～7 d干預組稱為預防組，將8～14 d干預組作為治療組。用藥劑量：丹參（764-3，購自天津血液研究所）為40 mg/（kg·d）。

1.2 組織標本的制備

Ⅰ組和Ⅱ組分別在生后滿7 d、14 d，Ⅲ組和Ⅳ組在生后滿14 d予10%水合氯醛腹腔麻醉后，取出腦組織，立即置于4%多聚甲醛固定液中，常規石蠟包埋，取海馬水平做冠狀切片，厚度為5 μm，用于HE染色、免疫組化和TUNEL檢測。

1.3 指標檢測方法

1.3.1 HE染色 腦組織切片常規蘇木素伊紅染色，光鏡下觀察腦組織病理變化。

1.3.2 SABC免疫組化法 兔抗鼠VEGF多克隆抗體（一抗）和配套使用的SABC免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。石蠟切片常規脫蠟水化后，按SABC免疫組化標準步驟進行操作。結果為半定量統計，依據染色程度和著色比例進行。染色程度：無染色為0；輕度為1；中度為2；重度為3。著色比例：未見為0；<1/4為1；1/4～1/2為2；>1/2為3，綜合兩種分數。在400倍光鏡下，每例觀察10個視野進行評分，取平均值為本例評分，陰性為2分以下， 陽性為2分以上。

1.3.3 TUNEL染色 采用德國Roche公司生產的TUNEL試劑盒進行檢測。實驗中以細胞核染成棕黃色的為陽性細胞，在400倍光鏡下隨機計數5個視野中500個細胞中的陽性細胞數，以平均每100個細胞中凋亡細胞個數作為凋亡指數。

1.4 統計學處理

VEGF表達以陽性或陰性表達為標記，各組間比較采用Fisher確切概率法，而凋亡指數以均數±標準差（x±s）表示，總體差異采用方差分析，組間比較采用兩兩檢驗。采用SPSS13統計軟件進行統計處理，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腦HE染色

空氣對照組光鏡下偶見細胞變性，高氧組可見較多變性神經元，表現為胞漿呈粉紅色的均勻嗜酸性染色，細胞固縮，細胞核部分深染，核仁不清。7 d組主要集中在大腦皮層，呈灶狀、層狀改變。外側較為明顯，至14 d時，海馬區、齒狀回被累及，損傷程度較7 d時有所加重。小腦病變不明顯，見圖1～2。使用764-3干預后病變明顯減少。

2.2 免疫組化染色（VEGF表達檢測結果）

空氣對照組VEGF大量表達，部位主要分布在海馬、皮質以及皮質下結構，其中皮質下區表達最多。高氧對照組VEGF表達低于空氣對照組，7 d時差異無顯著性（P>0.05），14 d時差異顯著（P<0.01）。經764-3干預后，預防組VEGF表達增高，但差異無顯著性（P>0.05），治療組VEGF表達則顯著增高（P<0.05），兩干預組間差異無顯著性（P>0.05），見表1、表3以及圖3～6。

2.3 凋亡指數

如表2所示，高氧7 d對照組凋亡指數顯著高于對應的空氣對照組（t′=37.71，P<0.01），至14 d時進一步增多（t′=18.39，P<0.01）。高氧7 d對照組凋亡細胞重點分布在大腦皮層，至14 d時，海馬區、齒狀回被累及。相比與高氧對照組，764-3干預組凋亡指數明顯下降（F=45.38，P<0.01），其中764-3預防組（t′=41.93，P<0.01），764-3治療組（t′=20.65，P<0.01），764-3治療組顯著低于預防組（t′=50.27，P<0.01）。見表2、3及圖7～10。

2.4 VEGF與凋亡指數的關系

將參與本次實驗的764-3干預組和7 d、14 d的高氧對照組大鼠共4組33只，分別按VEGF表達陰性（19只）和陽性（14只）分為二組來統計凋亡指數，可以看出VEGF表達陽性組凋亡指數為16.31±12.25較低，VEGF表達陰性組凋亡指數為39.56±19.13則較高，且差異有統計學意義（t′=5.41，P<0.01）。見表4。

3 討論

高氧對新生兒發育影響的研究目前主要集中在肺損傷和視網膜損傷上，對腦發育影響的報道甚少。嚙齒類動物出生后2周以內處于腦的快速發育期，大約相當于人類6個月胎兒至生后3歲幼兒，是對非生理氧毒性的敏感時期[2]。故本研究采用足月新生大鼠腦模型作為人類早產兒腦發育的研究基礎，建立高氧腦損傷模型，旨在明確高氧對新生兒期腦發育影響的損傷機制，進而指導臨床防治工作。本實驗采用7 d和14 d兩個時間點，研究高氧對腦細胞損傷的時間依從性。從HE染色和TUNEL研究結果來看，高氧對照組腦細胞水腫變性和凋亡細胞明顯增多（P<0.01），7 d以前主要集中在大腦皮層，7 d以后損傷范圍隨吸氧時間延長而增大。實驗結果表明高氧對腦細胞有損傷作用，且隨高氧暴露時間延長而逐漸加重。而凋亡細胞的區域性分布則提示高氧對腦細胞的損傷具有一定的部位選擇性，以上結果警示臨床醫師在使用高氧治療新生兒疾病時應慎重，盡量減少吸入時間以避免對患兒造成氧損傷。

研究發現高氧對照組7 d VEGF表達低于空氣對照組，但無顯著差異（P>0.05）；至14 d時VEGF表達明顯低于空氣對照組（P<0.01），提示長時間持續吸入高氧可造成腦組織VEGF表達減少。Nabeyrat E等[4]報道，高氧通過抑制CDK2-cyclinE活性和激活P21基因表達，使血管緊張素轉換酶Ⅱ增殖和分化受到抑制，可能是暴露于高氧過程中組織VEGF表達減少的關鍵因素。VEGF作為一種特異性的促內皮增殖的生長因子，除了具有促進新生血管形成、改善缺血部位的作用以外，還有直接保護神經細胞的作用[5]。因此我們推論高氧造成腦損傷的一條途徑是通過減少VEGF的表達來實現的，同時提示及時補充VEGF可以用來治療高氧腦損傷，為臨床治療提供了新思路。使用764-3干預后，VEGF的表達有了不同程度的上升。764-3預防組高于高氧對照組，但差異無顯著性（P>0.05），764-3治療組VEGF的表達顯著高于高氧對照組（P<0.05），提示早期使用764-3不能顯著提高VEGF的表達水平，但在損傷后期給予764-3可以有效地提高VEGF的表達水平。

764-3具有抗氧化、抗炎、抗凝等多種功效，其抗氧化作用較顯著，又有Ca2+拮抗劑作用，可減少氧自由基的產生，從實驗中可以看出干預組的凋亡指數較高氧對照組明顯減少（P<0.01），提示早期使用764-3可以有效地延緩高氧腦損傷，后期使用764-3可以有效地修復腦損傷，進一步證實了764-3對腦細胞的保護作用。其中治療組的凋亡指數顯著低于預防組，提示764-3的神經保護作用重點體現在治療作用上，推測可能是與7～14 d是氧自由基產生的高峰期[6]以及764-3具有較強的組織修復作用有關，有待于進一步研究證實。蔣一茵等[7]發現764-3能夠顯著提升高氧損傷后新生大鼠肺組織SOD含量，降低肺細胞凋亡指數從而發揮保護作用。王建社等[8]發現復方丹參具有下調神經細胞nNOS、iNOS表達，減少NO生成，抑制細胞凋亡，減輕缺血再灌注對大鼠大腦皮層神經細胞損傷的作用。總之764-3可以通過多種途徑減少細胞凋亡從而發揮保護作用。

另外我們發現VEGF表達陽性組凋亡指數低，VEGF表達陰性組凋亡指數則較高，且差異有統計學意義（P<0.01），提示VEGF可以顯著減少細胞凋亡。Zachary I等[9]發現VEGF可以抑制神經細胞凋亡，姜曙等[10]發現VEGF可以通過VEGF受體對星形膠質細胞發揮保護作用。近年來發現VEGF具有直接的神經保護作用。冀紅等[11]發現補充外源性VEGF可以減少新生鼠缺血缺氧性腦損傷造成的腦細胞凋亡。周旋等[12]發現VEGF-C對大鼠近端腎小管上皮細胞的凋亡有保護作用。推測764-3可以通過提高VEGF的表達來減少腦細胞凋亡，從而減輕高氧對腦細胞的損傷。VEGF制劑已經用于臨床治療，但價格昂貴，推廣受限，而764-3可以顯著提高VEGF的表達，且資源豐富，價格相對較低，更符合我國國情。

綜上所述：此次試驗提示（1）高氧對腦細胞的損傷具有時間依從性和部位選擇性；（2）高氧造成新生大鼠腦損傷的一種機制可能是通過降低VEGF表達來實現的；764-3緩解高氧腦損傷的一種機制可能是通過上調VEGF的表達來抑制腦細胞凋亡而實現的；（3）764-3的保護作用重點體現在治療作用上。764-3是我國傳統中藥丹參的提取物，它價格低廉，來源廣泛，其研究將具有廣泛前景。但本次研究只采用了單劑量實驗，而且就764-3抗腦損傷的研究比較表淺，故還有待于進一步深入研究其機制及合適的劑量，為臨床用藥提供動物實驗依據。

[參考文獻]

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[12] 周旋，裴廣暢，廖盼麗，等. 血管內皮生長因子C對大鼠近端腎小管上皮細胞凋亡的保護作用[J]. 臨床腎臟病雜志，2012，12（1）：34-36.

（收稿日期：2013-07-02）