酶聯法與放免法定量檢測血液制品中抗—HBS效價的比較

摘 要：目的：比較酶聯法與放免法定量檢測血液制品中抗-HBS效價的差異及各自的特點。方法：用酶聯法和放免法分別檢測靜注人免疫球蛋白（pH4）和乙型肝炎人免疫球蛋白中抗-HBS效價各10個樣本，每個樣本重復檢測20次。同時進行重復性、線性的比較，并進一步探討兩種方法各自的特點。結果：放免法重復性優于酶聯法，但線性不及酶聯法。結論：在檢測時應選擇放免法，需注意樣本稀釋后的效價應在標準曲線10mIU/ml到120mIU/ml之間。

關鍵詞：乙型肝炎病毒表面抗體；酶聯免疫法；放射免疫法

中圖分類號：R331.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-0515（2013）7-034-02

乙型肝炎是一種嚴重危害人類健康的傳染病，它由乙肝病的感染引起。全世界乙肝攜帶者達5億之多，我國乙肝攜帶者高于人群的10%[1]。急性乙肝中會有20%轉為慢性，進而可能發展為肝硬化和肝癌【2】。對于低免疫或無免疫人群，注射血液制品使其快速達到暫時免疫保護狀態，具有很大的臨床學意義。常用的抗-HBS效價的檢測方法有酶聯免疫法和放射免疫法。為此，特取2個不同品種的血液制品分別用酶免法與放免法進行抗-HBS效價檢測，現介紹如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 我公司生產的靜注人免疫球蛋白（pH4）和乙型肝炎人免疫球蛋白

1.1.2 標準品 抗HBS免疫球蛋白國家標準品（非人用）。批號20041001，含量2.5IU/支。

1.1.3 試劑 酶聯法：北京萬泰生物藥業股份有限公司；放免法：北京北方生物技術研究所。

1.1.4 設備 酶聯法：酶標儀（MK3 上海熱電儀器有限公司）、電子恒溫水箱（HH.WZ1.600 北京中興偉業儀器有限公司）；放免法：γ放射免疫計數器（FJ-2008PS 西安核儀器廠）、自動洗珠器（IV 北京天石醫療用品制作所）、冷凍水浴恒溫振蕩器（SHA-2 金壇市盛威實驗儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 試驗方法

1.2.1.1重復性比較 分別用兩種方法對10批靜注人免疫球蛋白（pH4）和乙型肝炎人免疫球蛋白抗-HBS效價進行檢測。靜注人免疫球蛋白（pH4）樣本做20倍、40倍、60倍3個稀釋級，乙型肝炎人免疫球蛋白樣本做1500倍、2000倍、3000倍3個稀釋級。每批樣本均重復檢測20次，計算相對標準偏差，結果見表1、表2。

1.2.1.2 線性比較 取國家標準品1支，加生理鹽水2.5ml稀釋成1IU/ml，分裝至小離心管中，-20°C貯存。取分裝好的1IU/ml的國家標準品1支，用生理鹽水稀釋為10mIU/ml，20mIU/ml，40mIU/ml，80mIU/ml，120mIU/ml，160mIU/ml。分別用酶聯法和放免法測定，以標準品各稀釋倍數理論值與測定值做雙對數回歸，比較R值，結果見表3。

1.2.2 酶聯法實驗步驟 a.吸取樣本、標準品各50μl，加入包被板相應孔中。樣本、標準品均做1孔平行樣。b.各孔加入酶試劑50μl，空白除外，振蕩混勻。c.用封板膜封板后，置37°C溫浴60分鐘。d.揭掉封板膜，用洗滌液洗板5次，最后一次盡量扣干e.每孔加入顯色劑A、B液各50μl，振蕩混勻，37°C避光顯色15分鐘。f.每孔加入終止液50μl，振蕩混勻。10分鐘內于酶標儀450nm處測定【3】。

1.2.3 放免法實驗步驟 a.吸取樣本、標準品各50μl，加入相應試管中。樣本、標準品均做1管平行樣。b.各管加入125I-HBsAg200μl。c.各管加入包被珠1粒，輕輕振蕩試管架以去除氣泡。20°C溫浴振蕩2小時。d.吸除反應液，用自動洗珠器清洗包被珠4次，每次注水4ml【4】。e.24小時內用γ放射免疫計數器測量每管CPM值。儀器本底測5次，取平均值。測量時間60秒，活度30000。

2 結果

2.2 線性比較

3 討論

抗-HBS的效價直接決定著靜注人免疫球蛋白（pH4）和乙型肝炎人免疫球蛋白藥品的有效性。穩定、準確的檢測結果是企業質量控制的關鍵，更是對消費者和社會不可推卸的責任。

根據以上試驗可以看出，酶聯法和放免法檢測結果的相對標準偏差均在10%以內，但酶聯法檢測結果的相對標準偏差明顯大于放免法。這是因為，酶聯法在檢測中影響因素較多，如水浴箱、移液器、酶標儀之間的差異及操作人員手法間的區別，加完終止液到酶標儀讀測時間間隔【5】，甚至液層厚度和實驗室溫度也會增加檢測結果的不確定度【6】。

放免法在檢測中影響因素相對較少，但線性比較則不及酶聯法。由于125I-HBsAg的衰變，使得160mIU/ml的線性較差。

綜上所述，在檢測靜注人免疫球蛋白（pH4）和乙型肝炎人免疫球蛋白抗-HBS的效價時應選擇放免法，需注意的是樣本稀釋后的濃度應在標準曲線10mIU/ml到120mIU/ml之間，才能確保檢測結果的準確性。

參考文獻：

【1】 何印雷 實時熒光PCR檢測乙肝病毒DNA的臨床意義【J】 實用醫學雜志，2006，13（22）：3954-3955

【2】 李引鈺 兩種免疫分析法檢測乙型肝炎的分析 檢驗醫學與臨床，2011，2（8）：349-350

【3】 乙型肝炎病毒表面抗體定量診測定劑盒（酶聯免疫法）使用說明書 北京萬泰生物藥業股份有限公司

【4】乙型肝炎病毒表面抗體定量診斷試劑盒使用說明書 北京北方生物技術研究所

【5】 王福俊 羅佳臻 兩種方法檢測低濃度乙型肝炎病毒表面抗體的探討 檢驗醫學與臨床，2007，6，4（6）：485-487

【6】 程秀吉 盧利軍 姜永莉 李愛軍 ELISA法檢測HBsAg結果不確定度評定 中華臨床醫學研究雜志，2006，2，12（3）：283-285