內源性神經激肽和降鈣素基因相關肽在大鼠心肌缺血后適應對心肌超氧化物歧化酶的作用

【摘要】 目的：研究神經激肽1（NK1）、降鈣素基因相關肽（CGRP）在大鼠缺血后適應對心肌超氧化物歧化酶（SOD）的作用。方法：隨機將SD雄性大鼠（350～400 g）分為5組：sham組（只穿線不結扎冠狀動脈）、I/R組（結扎冠狀動脈左前降支30 min，再灌注120 min）、ipost組（結扎冠狀動脈左前降支30 min，再灌注10 s夾閉10 s，如此反復3次后持續再灌注120 min）、CGRP8-37+ipost組（結扎冠狀動脈左前降支25 min，按1μg/kg劑量從尾靜脈給藥CGRP8-37，5 min行后處理再灌注同ipost組）、D-SP+ipost組（結扎冠狀動脈左前降支25 min，按1μg/kg劑量從尾靜脈給藥D-SP，5 min行后處理再灌注同ipost組）；快速液氮冷凍各組缺血心肌組織并提取心肌總蛋白，行總蛋白定量，用酶聯免疫吸附技術檢測心肌SOD的表達，分光光度法檢測Caspase-3活性。結果：（1）與sham組比較，I/R組Caspase-3、SOD均增多（P<0.01）；（2）與I/R組比較，ipost組SOD增多（P>0.05），Caspase-3減少（P<0.01）；（3）與ipost組比較：CGRP8-37+ipost組SOD降低（P<0.01），Caspase-3增多（P>0.05），D-SP+ipost組SOD降低（P<0.01），Caspase-3增多（P>0.05）。結論：神經激肽1降鈣素基因相關肽（CGRP）通過上調缺血心肌SOD表達對缺血后適應心肌起保護作用。

【關鍵詞】 NK1受體； CGRP受體； 缺血后適應； 超氧化物歧化酶； Caspase-3

目前研究證實，缺血后適應對缺血再灌注心肌有保護作用[1-2]，也有研究證實，缺血心肌再灌注可造成缺血/再灌注損傷[3]，Kevin等[4]研究發現，再灌注早期心肌大量氧自由基產生可造成細胞的損傷使心肌細胞發生凋亡，且Caspase-3在凋亡中起重要作用[5]。而感覺神經通過釋放感覺神經肽（CGRP和SP）可以減輕心肌缺血再灌注的損傷[6]。SOD是生物體內重要的自由基清除劑，在保護酶中起重要作用[7]。本實驗擬探討感覺神經肽在缺血后適應中對超氧化物歧化酶是否有影響。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究采用大鼠作為研究對象。實驗設計及過程符合本校倫理委員會要求并獲批準。主要藥品及試劑：ELISA試劑盒（檢測SOD，RD，USA）；D-SP（Sigma，USA），CGRP8-37（Sigma，USA）。

1.2 大鼠心臟缺血再灌注模型 大鼠術前須禁食12 h，可自由飲水。稱重后，20%烏拉坦（1.2 g/kg）腹腔注射麻醉后將大鼠固定于實驗臺，連接標準Ⅱ導聯，尾靜脈置入24 G套管留置針以方便給藥。頸部皮膚消毒后于正中作一長約0.5 cm的切口，逐層鈍性分離各層組織暴露氣管，于甲狀軟骨下2～3 mm行氣管切開，置入小動物用氣管導管，用3-0慕絲線固定后逐層縫合皮膚切口。接小動物專用呼吸機行人工通氣（呼吸頻率70次/min，潮氣量6～7 ml/次），穩定10 min左右，在大鼠左側胸壁第3、4肋間距離胸骨左緣約0.5 cm開胸，逐層鈍性分離暴露心臟，以左冠狀靜脈主干為標志，在左心耳下方1～2 mm處以6-0無損傷縫合線穿針，進針深度1.5 mm左右，結扎冠狀動脈左前降支30 min，松結扎線再灌注120 min。

1.3 實驗分組 將實驗動物隨機分為5組，每組10只：sham組（只穿線不結扎冠狀動脈）、I/R組（結扎冠狀動脈左前降支30 min再灌注120 min）、ipost組（結扎冠狀動脈左前降支30 min，然后行再灌注10 s夾閉10 s，如此反復3次后持續再灌注120 min）、CGRP8-37+ipost組（結扎冠狀動脈左前降支25 min，按1μg/kg劑量給藥CGRP8-37，5 min行后處理再灌注同ipost組）、D-SP+ipost組（結扎冠狀動脈左前降支25 min，按1μg/kg劑量給藥D-SP，5 min行后處理再灌注同ipost組）。

1.4 指標測定 用酶聯免疫吸附技術檢測心肌SOD的表達，分光光度法檢測Caspaspase-3活性。

1.5 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件對數據進行統計學分析，計量資料以（x±s）表示，采用兩獨立樣本t檢驗和單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

與sham組比較，I/R組SOD增多（P<0.01），Caspase-3增多（P<0.01）；與I/R組比較，ipost組SOD增多（P>0.05），Caspase-3減少（P<0.01）；與ipost組比較，CGRP8-37+ipost組SOD減少（P<0.01），Caspase-3增多（P>0.05），D-SP+ipost組SOD減少（P<0.01），Caspase-3增多（P>0.05）。見表1。

3 討論

以往研究表明，缺血后適應對缺血心肌具有保護作用[8]，本實驗研究結果顯示，缺血再灌注心肌Caspase-3表達較假手術組明顯升高，故認為缺血再灌注心肌細胞發生了凋亡，而缺血后適應心肌Caspase-3表達較缺血再灌注明顯降低則證實以缺血后適應對心肌的保護作用，單獨拮抗感覺神經肽（P物質或CGRP）后的缺血后適應心肌均較缺血后適應心肌Caspase-3表達升高，提示感覺神經肽參與了缺血后適應的心肌保護作用。本實驗研究結果顯示I/R組較sham組SOD表達顯著升高，提示缺血引發應激反應刺激氧自由基保護酶表達升高[9]；ipost組較I/R組SOD表達升高，結合缺血后適應的心肌保護作用[10]，提示缺血后適應可能進一步激發SOD的表達對心肌起保護作用；單獨拮抗感覺神經肽（P物質或CGRP）后的缺血后適應心肌均較缺血后適應SOD表達降低進一步提示感覺神經肽在缺血后適應中參與上調心肌SOD的表達。

綜上所述，本實驗結果顯示，神經激肽1受體拮抗劑和CGRP受體拮抗劑可部分增強缺血后處理的心肌凋亡，并可顯著抑制心肌超氧化物歧化酶的表達。提示內源性感覺神經肽SP、CGRP通過上調缺血心肌SOD的表達對缺血后適應心肌起保護作用。

參考文獻

[1]王秀萍，郭政.降鈣素基因相關肽與疼痛和免疫炎癥反應[J].山西醫藥雜志，2005，34（6）：481-483.

[2]連亮華，陳德偉.缺血后適應減少心肌缺血再灌注損傷的研究進展[J].中國誤診學雜志，2007，7（7），1441-1443.

[3] Lavrik I，Golks A，Krammer P H.Death receptor signaling[J].J Cell Sci，2005，118（2）：265-267.

[4] Kevin L G，Novaliga E，Stove D F.Reactive oxygen species as mediators of cardiacinjury and protection：relevance to anesthesia practice[J].Anesth Analg，2005，101（5）：1275-1287.

[5] Nicholson D W.Caspase structure，proteolytic substrates， and function during apototic cell death[J].Cell Death Differ，1999，6（11）：1028-1042.

[6]賴西南.感覺神經肽P物質在損傷修復中的作用及分子機制[J].創傷外科雜志，2008，10（6）：559-561.

[7]付漢維，彭禮飛.錳超氧化物歧化酶的研究進展[J].公共衛生與預防醫學，2010，8（4）：17-19.

[8]陳鴻云，光雪峰，白文偉.心肌保護策略-后適應研究進展[J].微循環學雜志，2007，17（2）：51-56.

[9]汪云春.亞低溫對大鼠局灶性腦缺血氧自由基和一氧化氮的影響[J].中國老年學雜志，2007，9（10）：135-136.

[10]周菲，秦永文.心肌后適應的研究[J].國際心血管病雜志，2007，34（3）：182-185.

（收稿日期：2013-02-28） （本文編輯：連勝利）