克氏原螯蝦腸道的組織化學研究

【摘 要】本文采用龍桂開浸銀法對克氏原螯蝦（Procambarus clarki）腸道嗜銀細胞的形態學特點和分布密度規律進行了觀察，結果顯示：嗜銀細胞在腸道各段均有分布，分布密度以前腸最多、中腸其次、后腸最少；嗜銀細胞在腸道成群分布，大多數嗜銀細胞呈圓形、卵圓形，也有些呈長條形、紡錘形、長頸瓶形、三角形、梨形等形態；克氏原螯蝦腸道的組織化學反應可能與其食性和消化特性有關。

【關鍵詞】克氏原螯蝦；龍桂開浸銀法；腸道；嗜銀細胞

克氏原螯蝦，又名克氏螯蝦、紅色沼澤螯蝦或淡水龍蝦，隸屬甲殼綱、軟甲亞綱、十足目、螯蝦科 [1]，原產于美國南部和墨西哥北部，后由日本傳入中國?？耸显r因其食性雜、生長快、繁殖和抗病能力強而種群發展迅速，廣泛分布在全國各地的湖泊、江河、池塘、溝渠、沼澤和稻田中，已成為重要的經濟水生動物，并已經取得大規模人工養殖的成功。

國內對克氏原螯蝦的研究主要涉及其幼體發育、營養成分及其他一些生物學方面的內容[2，3]，對其腸道的基礎研究很薄弱。龍桂開浸銀法是使用較廣且能比較全面地反映消化道內分泌細胞總量的一種染色方法[4]。在動物的進化過程中，腸道嗜銀細胞起源較早，廣泛存在于各類脊椎動物的消化道中[5，6]，但在無脊椎動物中報道較少，尚未見關于克氏原螯蝦的報道。通過對其消化道嗜銀細胞的分布及形態特點的試驗，可進一步豐富比較內分泌學資料，更能比較多地了解克氏原螯蝦腸道的組織化學結構特點。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用克氏原螯蝦于2013年7月由南陵縣煙墩水產養殖專業合作社提供，共8只，平均體重為24g，平均全長為10cm。

1.2 取材

將8只克氏原螯蝦取出，用電子秤稱重（±0.001g），用直尺測量全長（±0.1cm），并記錄。活體解剖，用鑷子將腸道從內臟中分離出來，并清除表面的脂肪和肝胰臟組織，然后用鑷子將腸道內的水分和食物顆粒碾出，剪取前腸、中腸和后腸各2段。

1.3 龍桂開浸銀法

（1）取材：清洗出3支干凈的容器（如廢棄的青霉素瓶子），并標上標簽（前腸、中腸、后腸），將對應的組織塊放入，用15%～20%福爾馬淋溶液固定3～5d。

（2）浸洗：用蒸餾水每隔0.5h換洗1次，共換洗3h，之后用解剖刀將組織塊修整成長約5mm、寬3mm的小塊。

（3）浸銀：將組織塊浸入25%的硝酸銀水溶液中，用濾紙將容器包裹起來，使其處于黑暗狀態下，避免硝酸銀受光氧化分解，然后放入37℃的恒溫箱中1～3d。

（4）用蒸餾水沖洗數次。

（5）浸入銀氨溶液中，浸泡3～5h。

（6）用蒸餾水略洗。

（7）還原：浸入福爾馬淋溶液中還原10～15h。

（8）用蒸餾水再次浸洗數分鐘。

（9）脫水：采用酒精脫水，濃度梯度分別為50%、70%、80%、90%、95%、無水酒精，每2個梯度的間隔時間為2h，最后用無水酒精重復脫水1次，然后依次將這些濃度的酒精倒入有組織塊的容器中。

（10）將脫完水的組織塊放入無水乙醇∶二甲苯=1∶1的溶液中浸泡1.5h。

（11）透明：采用二甲苯為透明劑，將脫水后的材料直接投入二甲苯溶液中浸泡20min。

（12）浸蠟：透明后將組織塊置入二甲苯∶石蠟=1∶1的混合液中約1.5h，之后放進液狀石蠟中浸蠟，放入57℃的烘箱中12h。

（13）石蠟包埋：折疊數個長方形紙盒，并將寫有前、中、后腸的標簽貼上，將紙盒放入1個較大一點的方形硬紙殼中，在硬紙殼底部開1個小洞，以便水能順利流出，把烘箱中的液狀石蠟倒入小紙盒中，迅速將組織塊放入紙盒中的液狀石蠟中，組織塊的縱向要與小紙盒的縱向保持平行（便于以后修整石蠟，切片時能順利切出腸道的橫切面），然后往擺有小紙盒的大硬紙殼中源源不斷的注入自來水，以加速冷卻，待石蠟基本固定后，將小紙盒從大硬紙殼中取出，放入裝有自來水的水盆中冷卻數小時，直至石蠟完全凝固成形。

（14）切片、展片、貼片：將包埋有組織塊的石蠟從小紙盒中取出，按縱向修整成等腰梯形（后部留大一點容易將其固定在小木塊上），且6個平面要比較平滑，組織塊四周均留有余蠟，將石蠟塊按照不同批次和前、中、后腸分開，然后放進1個小塑料袋中，并標上寫有批次和前、中、后腸的標簽。將修好的石蠟塊與小木塊放在酒精燈上微烤，把石蠟塊粘在小木塊上，把粘好的木塊固定在切片機上，把切片機的刻度調為6μm，手搖動切片機，即可切出6μm厚的組織片，用毛筆接住切出的組織片，放在準備好的濾紙上（事先準備好濾紙和水盆，水盆中倒入37～42℃的溫水，放入溫度計，以便及時調整水溫），然后挑出較完整的2～3片，用鑷子夾住，迅速展入37～42℃的溫水中，讓其充分展開，待組織片上的小氣泡完全消失后，用涂有中性膠的載玻片將組織片撈出，讓其附著于載玻片上，1個載玻片上放2段標本，并將寫好批次和前、中、后腸的標簽紙貼上，放入染色缸中，將載玻片置于40.5℃的烘箱中烘烤2～3d。

（15）脫蠟：把烘箱中裝有載玻片的染色缸取出，倒入二甲苯脫蠟15min以上，然后移入另一個染色缸，再次脫蠟15min。

（16）將脫過蠟的載玻片一一擺在濾紙上，然后從烘箱中取出準備好的蓋玻片。在組織片段上滴1滴中性樹膠之后，讓蓋玻片與載玻片呈45角，緩慢放下蓋玻片蓋住組織片，然后放入37℃烘箱中烘片3～4d。

1.4 觀察分析

（1）把做好的切片放在光學顯微鏡下用10×40倍的鏡片觀察，以一個視野為單位計嗜銀細胞的個數，并記錄。

（2）通過SAS of Windows 8.01 軟件，把記錄的數據進行方差分析，得到試驗結果。

2 結果

嗜銀細胞的胞質與突起中充滿嗜銀顆粒，嗜銀顆粒呈黑色或黑棕色，背景為淡黃色或黃色，細胞核被染成黃色或淺黃色，對比非常鮮明，容易辨認與區分。

2.2 嗜銀細胞的形態學特點

嗜銀細胞的形狀多種多樣，有圓形、卵圓形、長條形、紡錘形、長頸瓶形、三角形、梨形以及其他各種不規則形狀，并有突起，其中8O%嗜銀細胞呈圓形和卵圓形，l0%左右為條形，其余為其他不同的形狀。

2.3 嗜銀細胞的分布密度

3 討論

3.1 嗜銀細胞的形態學特點與生理機能

克氏原螯蝦腸道上的嗜銀細胞多為開放型細胞，主要有圓形、卵圓形，長條形、紡錘形、長頸瓶形、三角形、梨形等形態，這種形態特點揭示了形態隨所處部位的相鄰上皮細胞的排列方式以及本身功能所需而各異。嗜銀細胞是腸道的內分泌細胞，早在本世紀初就有學者對嗜銀細胞進行了研究，確認嗜銀細胞是一種內分泌細胞。也有一些學者支持外分泌功能，還有些學者認為嗜銀細胞具有內、外分泌2種功能。腸道內分泌細胞能接受化學和物理刺激，并釋放5-羥色胺和各種激素到循環血液中去。本文也觀察到，嗜銀細胞從突起穿過基膜到達固有層，也見嗜銀顆粒直接從細胞到達固有層，另外還見有許多細胞的突起末端有散在的嗜銀顆粒，并靠近固有層，這和黃威權[7]等人觀點一樣，他們也認為嗜銀顆粒可以通過擴散和直接釋放2種形式到固有層?，F在研究結果表明，魚類腸道內分泌細胞釋放的激素對靶細胞有4種生理作用方式，即內分泌、旁分泌、神經內分泌和腔內分泌。本試驗證實了克氏原螯蝦至少有其中2種方式，即內分泌和腔內分泌；關于旁分泌，本文也觀察到少量嗜銀細胞有突起伸向鄰近細胞，這為此種方式的存在提供了形態學證據。

3.2 嗜銀細胞的分布密度規律

到目前為止，國內外學者僅在幾十種魚的胃腸道中發現嗜銀細胞，本試驗觀察到克氏原螯蝦的腸道中有著豐富的嗜銀細胞。克氏原螯蝦嗜銀細胞以細胞群的形式分布在腸道的前、中、后腸，從前腸、中腸到后腸的分布密度呈遞減趨勢。這種分布規律與克氏原螯蝦的腸道消化特點相適應，因為食物首先進入腸道中的前腸，刺激前腸的嗜銀細胞分泌激素，此時食物對前腸有較大的機械刺激作用，食物中的化學成分濃度最大，所以前腸的嗜銀細胞最為豐富，因而加強了激素的分泌。隨著食物消化吸收的進程，食物對腸的機械和化學刺激減弱，嗜銀細胞的分布密度漸疏。

筆者認為，在對克氏原螯蝦的腸道組織化學研究中，由于自己在試驗中的種種失誤和操作不熟練，也可能會導致某些結論比較片面，具體的研究結論還有待進一步的研究加以證明。

參考文獻

[1]堵南山.甲殼動物學（下）[M].北京科學出版社，1993：821-822.

[2]郭曉鳴，朱松泉.克氏原螯蝦幼體發育的初步研究[J].動物學報，1997，43（4）：372-381.

[3]溫小波，庫天梅，羅靜波.克氏原螯蝦耗氧率及窒息點的研究[J].大連水產學院學報，2003，18（3）：170-174

[4]曾小魯.實用生物學制片技術[M].北京高等教育出版社，1989：177-178.

[5]El-Salhy， M Grimelius L.The endocrine cells of the gastro- intestinal mucosa of a squamate reptile .The grass lizard （Mabuya quinquetaeniata）.A histological and immuno-histochemical study.Biomedical Research，1985，6（6）：371-375.

[6]唐曉雯，鄭一守.不同脊椎動物消化道內52羥色胺免疫染色細胞的分布[J].動物學研究，1991，12（3）：293-298.

[7]黃威權，黃蔭喬，王文超等.大鼠小腸嗜銀、親銀細胞的分布及形態學觀察[J].解剖學報，1985，16（4）：412-416.