擬南芥AtWNK9基因的定位及表達分析

基金項目：國家自然科學基金資助項目（31171176）；湖南省自然科學基金資助項目（11JJA002）；青年教師成長計劃項目（531107040602）

作者簡介：趙小英（1973-），女，湖南慈利人，湖南大學副教授

摘要：AtWNK9為擬南芥WNK（With no lysine kinase）激酶家族成員，其功能尚不清楚采用生物信息學和生物學實驗相結合的方法，對AtWNK9蛋白結構、亞細胞定位、啟動子元件、基因表達模式進行了分析研究發現，AtWNK9定位在細胞核中；該基因在擬南芥根中高效表達，其表達受ABA，NaCl、葡萄糖、熱和冷等非生物脅迫處理強烈誘導結果表明，AtWNK9為非生物脅迫反應相關基因，并可能參與根的生長發育

關鍵詞：基因表達；擬南芥；AtWNK9

中圖分類號：Q94文獻標識碼：A

WNK激酶（With no lysine kinase）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于蛋白激酶家族成員之一，因其家族成員在激酶功能域缺乏保守的賴氨酸而得名該激酶家族成員在通常保守的位于激酶區域第二個亞結構域缺乏一個賴氨酸殘基，動物WNK激酶中賴氨酸被半胱氨酸所替代，在植物中常被天冬酰氨（ N）或絲氨酸（ S ）替代，但激酶的生物活性沒有發生變化，因此表明WNK激酶是一種特殊的蛋白激酶

Nakamichi等在雙子葉植物擬南芥中克隆到植物中第一個WNK基因AtWNK1，隨后又成功分離到了AtWNK2-98個WNK基因，并發現AtWNK2，AtWNK4，AtWNK6涉及擬南芥晝夜節律的調控過程AtWNK2，AtWNK5，AtWNK8的TDNA插入突變導致擬南芥早開花，AtWNK1的TDNA插入突變表現出了晚花的表型最新研究發現，破壞AtWNK8能提高擬南芥對鹽和滲透壓力的抗性 目前，在單子葉植物水稻中發現7個WNK基因，其中OsWNK1被發現參與各種非生物脅迫如冷、熱、鹽、干旱脅迫等Wang等在大豆中鑒定了一個根特異性的WNK同源基因，GmWNK1，它通過與ABA分解代謝相關的蛋白GmCYP707A1相互作用微調ABA的水平，從而調控大豆晚期側根的發育隨后又發現GmWNK1能增強植物對NaCl和滲透壓的抗性目前，有關擬南芥AtWNK9基因的功能尚處于未知狀態，因此系統研究AtWNK9基因的功能對全面了解擬南芥WNK激酶的功能具有十分重要的意義

生物信息學作為研究過程中的一項技術和開發工具在核酸及蛋白質序列分析及功能預測中發揮重要的作用基因蛋白結構與表達的生物信息學分析結果對后續基因功能研究有重要的指導意義本研究采用生物信息學和生物學實驗相結合的手段，對AtWNK9蛋白結構、亞細胞以及基因表達情況進行了分析，這將為進一步研究該基因的功能奠定基礎

1 材料與方法

11植物材料和載體

擬南芥野生型Col4為哥倫比亞生態型，大腸桿菌DH5α菌株和pA7YFP載體均為本實驗室保存

12生物信息學分析

運用簡單模塊構架搜索工具SMART（Simple Modular Architecture Research Tool）（http：//smartemblheidelbergde/smart/）和NCBI網站提供的保守結構域檢索工具CDART（Conserved Domain Architecture Retrieval Tool）（http：//wwwncbinlmnihgov/Structure/）對AtWNK9蛋白進行保守結構域分析；利用丹麥科技大學（DTU）的CBS服務器上的NetPhos20 Server程序（http：//wwwcbsdtudk/services/NetPhos/）分析磷酸化位點；利用WoLF PSORT工具（http：//wolfsortseqcbrcjp）和TAIR網站中提供的蛋白亞細胞定位數據庫SUBA （The SubCellular Proteomic Database）（ http：//suba2plantenergyuwaeduau/）預測蛋白質亞細胞定位[13-14]；通過TAIR網站中提供的Arabidopsis eFP Browser鏈接（http：//bbcbotanyutorontoca/efp/）分析AtWNK9基因的表達譜[15]利用植物Plant CARE在線分析工具（http：//bioinformaticspsbugentbe/webtools/plantcare/）對AtWNK9基因上游1 000 bp的啟動子順式作用元件進行分析[16]

13 35S：：AtWNK9YFP 融合表達載體構建

以擬南芥野生型Col4為材料，采用RTPCR方法，首先提取總RNA并逆轉錄為cDNA，然后以此cDNA為模板，利用引物AtWNK9YFPF（ACGCGTCGACATGATGAACAATCTC AGCCATCTT），AtWNK9YFPR（GGACTAGTGT CTTCTTCGTCAGAG TCGTTT）（下劃線堿基部分分別為SalⅠ和SpeⅠ酶切序列），通過PCR擴增得到AtWNK9目的基因的全長cDNA序列采用酶切連接的克隆方法，將該片段連接到pA7YFP載體中，構建綠色熒光蛋白與AtWNK9基因融合表達的載體35S：：AtWNK9YFP

14PEG介導的原生質體轉化

為確定AtWNK9基因在細胞中表達的具體部位，將上述構建的35S：：AtWNK9YFP進行原生質體轉化參照文獻[17]的方法，將未抽臺前的葉片約90片，切成1 mm寬的長條（長度不定），置于500 mmol甘露醇溶液中將細條撈出，置于含有纖維素酶和果膠酶的酶解液中，黑暗23 ℃，40～50 r/min解析3 h以制備原生質體取約10～20 μg 35S：：AtWNK9YFP質粒于15 mL離心管中，隨后依次加入100 μL的原生質體和110 μL PEG/Ca溶液，輕柔混勻放置20～30 min后，去除PEG，用W5溶液（154 mM NaCl，125 mM CaCl2， 5 mM KCl，2 mM MES）終止反應，然后置于云孔板內23 ℃ 黑暗下培養6～18 h后，在熒光倒置顯微鏡下觀察和分析AtWNK9的亞細胞定位

15脅迫處理

擬南芥野生型Col4種子經深層（1% 次氯酸鈉10 min，無菌水洗5次）消毒后，4 ℃ 春化3～4 d，然后播種在MS培養基上放置在22～23 ℃培養箱連續白光培養12 d后，用ABA（100 μM）[18]NaCl（300 mM）[19]、葡萄糖（2%）[20]、熱（37 ℃）[21]、冷（4 ℃）[22]進行處理，清水處理作為對照，在不同的時間點收取材料，液氮速凍后，于-80 ℃保存，用于后續的實時定量PCR分析

16實時定量PCR分析

采用TRIGene（GenStar）提取總RNA，按照Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit （Fermentas）試劑盒提供的方法，反轉錄合成cDNA在定量PCR儀（Mx3 000 P）上，按照SYBR Premix Ex TaqTM （Perfect Real Time）（TakaRa）定量試劑盒的說明進行定量PCRPCR反應條件為： 94 ℃預變性10 min，94 ℃變性 30 s，57 ℃退火30 s， 72 ℃延伸 30 s， 40個循環每個實驗至少重復3次，持家基因ACTIN2 作為分子內標本研究采用的定量PCR引物見表1

2 結果

21AtWNK9蛋白結構分析

運用簡單模塊構架搜索工具SMART和NCBI中的CDART軟件對AtWNK9蛋白進行保守結構域分析，發現AtWNK9在第25到第282個氨基酸區域，包含了一個保守的絲氨酸蘇氨酸激酶催化結構域（STYKc）和一個蛋白激酶催化結構域（PKc）（圖1（a）），因此，AtWNK9被歸類為絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶家族利用丹麥科技大學（DTU）的CBS服務器上的NetPhos20 Server程序對AtWNK9蛋白進行磷酸化位點分析從圖中可看出，AtWNK9蛋白氨基酸序列中的17個絲氨酸（S），2個蘇氨酸（Thr）和7個酪氨酸（Tyr）蛋白激酶磷酸化位點（圖1（b））這說明AtWNK9具有自身磷酸化的特點

22AtWNK9基因亞細胞定位分析

采用WoLF PSORT工具對AtWNK9的亞細胞定位進行預測，得知AtWNK9定位在胞質中；采用TAIR網站中提供的蛋白亞細胞定位數據庫SUBA進行預測，得知該基因定位在細胞核中為進一步確定AtWNK9的亞細胞定位，我們采用PEG介導的原生質體轉化方法[17]進行了分析研究

首先，采用PCR擴增，得到AtWNK9的全長cDNA序列，大小為1 400 bp左右（圖2（a））用限制性內切酶SaIⅠ和SpeⅠ將該片段和pA7YFP載體進行雙酶切，分別得到大小為4 900左右和1 400 bp左右的酶切片段（圖2（b））回收酶切片段，用T4DNA連接酶進行連接反應將反應液轉化大腸桿菌DH5 α，然后對陽性克隆進行PCR和雙酶切（HindⅢ和BamHⅠ）鑒定，PCR產物及酶切片段大小與預期片段大小相一致（圖2（c），（d）），表明成功構建了35S：： AtWNK9YFP重組質粒隨后，以載體35S：：YFP質粒作為對照，將重組質粒35S：：AtWNK9YFP轉化擬南芥原生質體，在熒光倒置顯微鏡下觀察融合基因的表達情況（圖3）綠色熒光蛋白基因YFP在細胞的所有部位都高效表達（圖3（b）），融合基因AtWNK9YFP則僅在細胞核中表達較強（圖3（d）），與蛋白亞細胞定位數據庫SUBA預測結果相一致，表明AtWNK9編碼核蛋白

23AtWNK9組織器官表達模式分析

基因的時空表達模式可為預測和研究其生物學

功能提供參考依據根據TAIR網站中eFP Browser連接提供的數據，對AtWNK9基因在擬南芥不同組織器官中的表達譜進行了分析整理（圖4（a））AtWNK9基因在擬南芥植株的根、下胚軸、葉、花等各個組織器官中均有不同水平的表達，在根中的表達量最高此外，AtWNK9在不同部位的葉片、莖、花和花粉中的表達也存在一定的差異但表達水平都比較低（圖4（a））為了進一步確定AtWNK9 基因在不同組織器官的表達模式，采用實時熒光定量PCR檢測了該基因在擬南芥根、蓮座葉、莖生葉、莖、花和果莢中的表達情況從圖4（b）中可看出，AtWNK9在所有被檢測的組織器官中均有表達，其中在根中的表達量最高，約為其它器官中的3～5倍，其次為莖這與eFP Browser連接提供的數據基本一致，推測AtWNK9可能參與根的生長發育

24 AtWNK9基因表達對非生物脅迫的響應

利用植物啟動子順式作用元件分析網站Plant CARE在線分析了AtWNK9基因上游1 000 bp的調控區域結果發現，AtWNK9基因的調控區域存在大量激素響應與脅迫響應相關的元件，包括赤霉素反應元件（GibberellinResponsive Element， GARE）、熱脅迫響應元件（HSE）、逆境和脅迫響應元件（TCrichrepeats）等順式作用元件

為了研究AtWNK9基因的表達是否響應激素、逆境脅迫，實驗中對12齡擬南芥幼苗分別進行ABA、鹽、葡萄糖、熱、冷脅迫處理，采用實時定量PCR分析了AtWNK9基因的表達情況結果如圖5所示，AtWNK9基因的表達受脅迫處理強烈誘導，其中ABA的誘導效應最明顯，AtWNK9的轉錄水平在ABA處理4 h即達到峰值，為對照處理的8～9倍，在隨后的8 h內其表達量仍然維持較高的水平；AtWNK9基因對NaCl處理的響應更快，在處理2 h達到最大值，為對照處理的8～9倍左右，隨處理時間延長AtWNK9基因的表達量迅速下降，但仍為對照處理的2～3倍；AtWNK9對葡萄糖、熱、冷脅迫的響應相對較弱，分別在葡萄糖處理4 h，熱、冷處理6 h達到最大值，為對照處理的5倍、3倍和6倍；AtWNK9對水處理（對照實驗）幾乎沒有響應，說明AtWNK9基因為植物脅迫反應相關基因

3討論

對基因的生物信息學分析，可為預測其生物學功能提供參考本研究首先利用生物信息學的手段對AtWNK9的核苷酸及蛋白質序列進行了保守結構域和磷酸化位點分析，發現AtWNK9基因包含與蛋白激酶催化結構域（PKc_）和絲氨酸蘇氨酸催化結構域（STYKc）具有高度相似性的結構域，且存在多個磷酸化位點，與WNK激酶家族中其他成員的結構特征一致[23]，因此，AtWNK9具有自身磷酸化特點，這還需作進一步研究

基因的表達部位及表達模式通常與基因的功能有緊密的聯系結合生物信息學分析、原生質體轉化及熒光定位分析，得知AtWNK9在細胞核中表達，說明AtWNK9基因編碼核蛋白此外，根據eFP Browser提供的數據及實時定量PCR分析，證明了AtWNK9基因在擬南芥根中高效表達，這與Wang等的RT～PCR實驗結果相吻合，說明AtWNK9可能參與根的生長發育

利用Plant CARE對AtWNK9啟動子順式作用元件進行分析，結果顯示：啟動子區域存在大量激素響應與脅迫響應相關元件通過激素和脅迫處理發現，AtWNK9基因的表達受ABA，NaCl等非生物脅迫強烈誘導，說明AtWNK9為非生物脅迫反應相關基因這為進一步研究AtWNK9基因的生物學功能奠定了良好基礎

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