唐古特大黃種子灌漿充實動態及發芽特性研究

曹師，郭鳳霞＊，陳垣，楊育峰，郭愛偉

（1．甘肅農業大學甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室 甘肅省中藥材規范化生產技術創新重點實驗室 生命科學技術學院，甘肅 蘭州730070；2．卓尼縣佛賜藏藥材開發有限責任公司，甘肅 甘南州747000；3．蘭州商學院長青學院，甘肅 蘭州730020）

唐古特大黃（Rheumtanguticum）為蓼科（Polygonaceae）大黃屬（Rheum）草本植物［1］，其與掌葉大黃（Rheumpalmatum）或藥用大黃（Rheumofficinale）均為大黃藥材的主要植物，主要分布在甘肅、青海及青海與西藏交界一帶，生于海拔1700～4300m高山溝谷、灌叢及半陰坡石堆中［2］，是中國特有種。大黃以干燥的根和根莖入藥，性味苦，寒。歸脾、胃、大腸、肝、心包經，具瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經、利濕退黃等功效［3］。甘肅隴南禮縣一帶主要種植掌葉大黃，甘南州一帶主要種植唐古特大黃。唐古特大黃是常用的中藏藥，而且已成為眾多功能性保健品及特色食品的主要原料。

然而，唐古特大黃的藥源主要來自野生品，隨著藥用范圍的擴大，過度采挖已導致野生資源日益減少，又得不到有效保護，野生品已幾近枯竭［4］，成為市場緊缺的名貴中藥材，市場供不應求，因此，發展人工種植是保護其野生資源的有效途徑。唐古特大黃依賴種子繁殖，種子質量直接影響藥材栽培的成效。肖蘇萍等［5］初步研究表明，大黃3個種的果實外觀形態和種子的物理特性指標都存在差異，青海野生唐古特大黃翅與果臍呈褐色，種子黑色，翅無皺縮，種子發芽率為48%～53%。楊君麗等［4］發現，唐古特大黃種子經超聲波處理后發芽率和發芽勢分別較對照提高8%和19%，高壓靜電處理后分別較對照提高17%和15%，50mg／kg的赤霉素處理后分別較對照高出16%和12%。張世璽［6］在田間試驗基礎上，總結出唐古特大黃規范化種植技術規程和主要病蟲害防治方法。徐文華等［7］研究發現唐古特大黃無菌苗各部位均可作為離體培養的良好外植體，下胚軸適宜分化誘導，子葉適宜愈傷組織誘導，并總結出適宜分化、生根和愈傷組織的培養基。以上研究對探尋唐古特大黃人工栽培關鍵技術和繁殖奠定了良好基礎。然而，目前尚無唐古特大黃種子采收標準，采收的種子成熟度參差不齊，嚴重影響田間出苗率和育苗成效。國內外對禾谷類作物種子灌漿與產量關系有較為深入的研究，干熱條件下種子灌漿速率高而持續期短的小麥（Triticumaestivum）品種產量高［8－9］。高蛋白大豆（Glycinemax）品系在灌漿期間維持每粒種子的最大同化吸收。近年來也涉及一些藥用植物種子灌漿特性的研究。研究［10－15］表明，紅花（Carthamus tinctorius）種子產量和種子油產量均與種子灌漿速率有關。種子灌漿成熟程度與種子發芽質量有密切關系，成熟優質掌葉大黃種子含水量在10%及以下。但至今對唐古特大黃種子灌漿充實規律及其種子發育過程中發芽質量動態變化的研究尚未見相關報道，而且隨著中藥資源產業化和現代化的發展，大規模育苗栽培成為中藥材規范化生產基地（Good Agriculture Practices，GAP）建設中的重要內容。因此，研究唐古特大黃種子灌漿動態及與發芽質量的內在聯系，探尋其種子最佳采收期具有重要意義，可為其GAP基地建設中確立其種子適宜采收標準提供科學依據。

1 材料與方法

1．1 試驗材料及試驗區概況

試驗材料為甘肅省甘南州卓尼縣扎古錄鎮卓尼縣佛賜藏藥材開發有限責任公司示范園區。試驗地海拔2785m，屬高寒、高海拔地帶。

1．2 種子灌漿動態測定

2012年6月1日，隨機選取唐古特大黃盛花期植株，選擇當天開花的花序掛牌標記，剪除頂部花蕾，預留基部發育一致的花朵。從6月10日開始，每天定時（下午14：00）取樣，每隔3d采收1次種子。每次采收10個果序，剝出小瘦果種子，隨機數取100粒種子立即稱其鮮重，重復3次，然后裝入與采收期對應編號的牛皮紙袋中，置通風干燥處晾曬后封口保存。待灌漿測定結束后，將種子統一帶回甘肅農業大學中草藥栽培與鑒定實驗室，80℃烘至恒重（12h），稱其干重，最后按公式［11－15］計算灌漿參數。其余種子均按采收期編號置于已編號對應另1組牛皮紙袋中，自然風干后保存備用于平行發芽試驗。

階段灌漿速率（stage filling rate，SFR，g／d·100種子）＝（后次百粒干重－前次百粒干重）／2次取樣間隔天數

平均灌漿速率（the average filling rate，AFR，g／d·100種子）＝開花后某天百粒干重／開花后天數

含水量（water content，%）＝100×（百粒鮮重－百粒干重）／百粒鮮重

脫水速率（dehydrate rate，DR，%／d）＝（前次含水量－后次含水量）／2次取樣相隔天數

1．3 種子發芽試驗

以上述備用于發芽的不同采收期種子為材料設計發芽試驗，在不同采收期的唐古特大黃種子中，分別隨機選取大小和飽滿度均一的種子各150粒，隨機分為3組，每組50粒（3次重復），分別置于對應編號的培養皿中，加入10mL滅菌蒸餾水浸種12h后，用滅菌蒸餾水沖洗3次，然后將其均勻擺放在鋪有2層濾紙的已滅菌對應編號的培養皿（直徑10cm）中，放置于25人工氣候箱（RXZ型，寧波）中。24h后開始統計發芽種子數，種子連續5 d不再發芽確定為發芽結束。最后參照農作物種子檢驗規程［16］計算各發芽指標。

發芽率（germination rate，%）＝已發芽種子數×100／供試種子總數

發芽勢（germination power，%）＝日發芽種子數達到最高峰發芽種子數×100／供試種子總數

發芽指數（germination index，GI）＝∑（當天的發芽種子數Gt／對應的發芽天數Dt）

1．4 數據分析

采用SPSS軟件對試驗數據進行方差分析和相關分析，作圖采用Excel 2003統計軟件。首先根據郭鳳霞等［13］Excel作圖法利用散點圖對種子百粒干重（Y）隨開花后天數（X）擬合Logistic曲線方程，開花后天數范圍為花后10～58d，百粒干重為該時期每隔3d采收百粒種子的測定值，每次為重復3次測定結果的平均值，共采收17次。然后用曲線方程可直線化方法［14］求出方程各參數，最后利用方程參數估算灌漿次級參數［11－15］。

2 結果與分析

2．1 唐古特大黃種子灌漿充實過程中種子百粒重的變化動態

大田觀察表明，4年生唐古特大黃在甘肅省卓尼縣扎古錄鎮5月上旬開始抽薹，5月中旬開始現蕾，5月下旬進入初花期，6月初進入盛花期，6月中上旬陸續進入結果期，7月中下旬花期開始結束，種子進入灌漿充實期，7月底種子陸續開始成熟，至8月中上旬種子全部成熟，小瘦果果柄開始形成離層從種株上脫落。

本研究從6月1日（盛花期）掛牌標記開花一致的唐古特大黃花序，于6月10日（開花后第10天）開始測定其種子百粒重的變化動態。測定結果表明（圖1），唐古特大黃單果種子從形成小瘦果開始到種子成熟其種子百粒鮮重經歷了快增期、緩增期、下降期和穩定期4個階段，灌漿過程持續60d左右。開花13d前，種子鮮重和干重均緩慢增加，花后13～19d種子百粒鮮重顯著增加（F＝15．4986，P＜0．05），花后19～31d，百粒鮮重穩定增長并在花后第31天左右達到最大值（3．2307g），隨后因種子脫水加快，種子鮮重極顯著迅速下降（F＝793．25，P＜0．01），種子干物質持續積累，至灌漿終期種子鮮重（1．1787g）接近干重（1．0687g）的水平，但兩者間的差異性仍達到顯著水平（t＝4．2489，P＜0．05）（圖1）。在整個種子灌漿過程中，開花后10～58d期間種子百粒鮮重的變化范圍為1．1787～3．2307g，變異系數27．61%；百粒干重的變化范圍為0．2657～1．0950g，變異系數42．88%，顯然百粒干重變異大，即在整個種子灌漿過程中，種子干物質積累量的動態變化幅度較大。

隨著開花天數的延長，唐古特大黃種子百粒干重呈“S”型變化趨勢（圖1），開花后種子的百粒干重極顯著增加（F＝880．7883，P＜0．01），并在花后第49天達到最大值（1．0950g），較百粒鮮重最大值出現的時間延后19d左右，之后隨灌漿持續時間的延長，種子在株上進一步完熟發育，種子百粒鮮重繼續下降，種子百粒干重雖也有所下降，但在花后49～58d期間其下降程度未達到顯著水平（F＝0．6448，P＞0．05），種子百粒干重基本穩定在1．0838g左右的水平。

圖1 唐古特大黃種子灌漿成熟過程中百粒重的變化Fig．1 Changes of 100－seed weight including fresh weight（FW）and dry weight（DW）in R． tanguticumplant

圖2 唐古特大黃百粒干重積累與開花后天數配合Logistic方程直線化擬合結果Fig．2 Linear result based on Logistic equation fitting dry weight of 100－seeds with filling duration in R． tanguticumplant

對種子百粒干重隨開花后天數的變化趨勢配合Logistic曲線方程，擬合結果及估算的灌漿各參數（圖2和表1）顯示，種子百粒干重積累動態符合Logistic曲線方程Y＝1．1529／1＋e2．4757－0．0967X，擬合指數極顯著（R2＝0．9611，P＜0．01），其中百粒干重極大值K為1．1529g，方程截距A為初始百粒干重轉換值，方程回歸系數B可反映出干物質積累速率。估算灌漿參數（表1）顯示，開花后種子成形后灌漿充實啟動，干物質逐漸積累，這一時期為漸增期，持續12d左右。開花后12～39d期間干物質積累速度加快，灌漿進入快增高峰期，此期間種子鮮重迅速增大并達到最大值，干重持續快速增加，花后26d左右即Logistic曲線拐點，即方程直線化后與x軸的交點處籽粒干物質積累速度最快（圖2）。開花36d后種子灌漿進入緩增期，種子干重緩慢積累，鮮重迅速下降，這與百粒重的變化趨勢基本相一致，至開花后58d單果種子已完全成熟，灌漿基本結束，說明單花灌漿持續期為58d左右，Logistic曲線方程估測的理論灌漿終期在花后73d，兩者相差15d。

2．2 唐古特大黃種子灌漿速率及平均灌漿速率的變化

唐古特大黃種子灌漿過程中灌漿速率呈波動變化規律（圖3）。從種子形成開始到花后28d，階段性灌漿速率呈波動上升趨勢，花后第22天左右出現灌漿低峰，接著迅速回升，于花后第28天左右階段性灌漿速率達到最大值（0．0457g／d），平均灌漿速率也處在開花10d后的最高水平，這與logistic方程估測的達到最大灌漿速率的時期即花后26d基本相一致（圖2和表1），之后灌漿速率迅速波動下降并在花后第37天出現一次低峰，而在此階段陰雨天氣較多，接著又逐漸回升，到花后第46天又一次出現高峰，之后開始持續下降，花后第52天開始，種子灌漿充實過程基本結束，階段性灌漿速率基本為零。在整個種子灌漿過程中，花后10～58d期間種子平均灌漿速率經歷先平穩下降然后平穩上升再平穩下降的動態變化趨勢，在開花后第28天左右達到較高水平，之后持續下降，灌漿末期維持在一個相對穩定的水平。

2．3 唐古特大黃種子灌漿過程中種子含水量及脫水速率的變化動態

唐古特大黃種子在灌漿充實期間，種子成形后開始持續脫水，種子含水量持續下降，其脫水速率隨灌漿進程的遞進呈先上升后下降的變化趨勢（圖4），從花后10d至49d期間種子脫水速率隨灌漿持續時間的延長波動上升并達到最大值，開花49d后種子脫水速率迅速下降，種子含水量則一直呈降低趨勢。至開花13d左右種子含水量達最高（88．79%），這與Logistic估計的干物質積累高峰起始時間（花后第12天）基本吻合（表1），之后隨著籽粒脫水速率的加快，含水量逐漸下降。花后第43天后隨脫水速率的加快，種子含水量急劇下降（圖4），此時種子干物質積累已進入緩增期（表1和圖1），花后第49天左右種子脫水速度最快（圖4），此時種子干物質積累已進入平穩期（表1和圖1），花后第55天后種子含水量下降至10%以下。整個種子灌漿過程中，種子含水量變化范圍為88．79%～9．32%，變異系數42．95%。

表1 唐古特大黃百粒干重積累與開花后天數配合Logistic方程估計的灌漿參數Table 1 Estimation of filling parameters based on Logistic equation fitting dry weight of 100－seeds with filling duration in R． tanguticum

圖3 唐古特大黃種子階段性灌漿速率和平均灌漿速率的動態變化Fig．3 Dynamic changes of the stage filling rate and the average filling rate in 100－seeds of R． tanguticumplant

圖4 唐古特大黃種子灌漿充實過程中含水量和脫水速率的變化動態Fig．4 Dynamic changes of water content（WC）and dehydrate rate（DR）in thousand seeds of R． tanguticumplant

2．4 灌漿過程中不同時期采收種子的發芽質量指標變化動態

在唐古特大黃種子整個灌漿過程中，不同時期采收的種子其終發芽率、發芽指數和發芽勢等發芽質量指標均存在極顯著差異（表2）。開花19d前采收的種子均不具備萌發能力，開花20d后采收的種子才開始具發芽能力。發芽過程中，種子從著床后第7天開始萌發，第17天發芽結束，以發芽第10天的種子發芽率作為發芽勢指標。圖5顯示，隨著灌漿持續時間的延長，采收種子的發芽率、發芽勢、發芽指數均顯著提高，開花后第34天采收的種子發芽率達到最大值（84．0%），之后發芽率維持在最大值附近波動變化，且變化不顯著（P＞0．05）。灌漿過程中種子發芽勢和發芽指數的動態變化趨勢大致相同，與發芽率相比較，發芽勢和發芽指數最大值出現在花后第49天，較發芽率最大值出現的時間延后6d左右，之后隨著種子在植株上進一步生長發育，種子的發芽率、發芽勢和發芽指數又都開始出現下降趨勢，但在49～52d期間發芽率、發芽勢和發芽指數等發芽質量指標的下降均不顯著（t＝0．1492，P＞0．05；t＝0．2822，P＞0．05；t＝0．092，P＞0．05）。

表2 種子灌漿期間不同時期采收種子各發芽指標的方差分析Table 2 Variance analysis of germination indicators for seeds harvested in different time during filling stage

圖5 唐古特大黃籽粒灌漿成熟過程中發芽特性的變化動態Fig．5 Dynamic trend of germination traits of R． tanguticumplant seeds in seed filling process

開花后10～52d期間灌漿及發芽指標相關分析表明（表3），種子干重積累量與灌漿持續期和種子脫水速率均呈極顯著正相關（P＜0．01），與種子發芽質量各指標也均呈極顯著正相關（P＜0．01），但與種子含水量呈極顯著負相關（P＜0．01），與灌漿速率相關性不大（P＞0．05）。種子百粒鮮重與種子含水量呈極顯著正相關（P＜0．01），與脫水速率呈極顯著負相關（P＜0．01），而與種子灌漿和發芽質量指標間的相關性均不顯著（P＞0．05）。種子發芽質量各指標均與灌漿持續期呈極顯著正相關（P＜0．01）外，與種子脫水速率也呈極顯著正相關（P＜0．01），而與種子含水量呈顯著負相關（P＜0．05）。種子發芽質量指標間均呈極顯著正相關（P＜0．01）。

3 討論與結論

灌漿期是指種子從開花到生理成熟這一持續的生理過程，超過這一時期籽粒營養成分的積累無明顯增加。種子的百粒重可反映種子的大小，也是構成種子產量的重要因素［18］，然而種子的百粒重的高低是由灌漿速率和灌漿持續時間決定的［19］。作物籽粒生長所需的80%～90%的碳水化合物都是來自開花后的同化產物，只有10%～20%來自原有儲備［20］。在地中海環境條件下，紅花品種的灌漿速率隨基因型的不同而異，57%以上種子產量的變化是由種子灌漿速率的變化造成的。提高灌漿速率可改善種子干物質組分，獲得較高收獲指數。選育灌漿速率高的品種是提高紅花產量的可行策略。因此，了解灌漿速率和灌漿持續期可以更好地掌握作物的生長發育狀態。本研究結果表明，在甘肅省甘南州卓尼縣栽培4年的唐古特大黃單花灌漿持續期58d左右，這與栽培3年的掌葉大黃種株［21］和栽培5年的麻花秦艽（Gentianastraminea）種株［22］單花種子灌漿持續期基本相一致，不同的是Logistic曲線方程估測的唐古特大黃灌漿終期極限在花后73d，與實際相差15d左右，而估測的掌葉大黃灌漿期極值為61d，麻花秦艽灌漿期極值為60d，說明若水肥條件和氣候適宜，唐古特大黃種子庫容可能增大，灌漿充實持續期可能會延長，這也從唐古特大黃種子灌漿過程中種子百粒干重實際出現的最大值1．0950g與方程估測的極大值1．1529g的差異性反映出來。唐古特大黃種子在成熟過程中，百粒鮮重經歷了快增、穩增、下降和穩定4個階段，即百粒鮮重從開花后持續增加并在花后31d達到最大值，隨后迅速下降到接近干重的水平。開花后10～58d種子灌漿過程中，百粒干重的變化趨勢呈“S”型曲線，符合Logistic曲線方程，即開花后種子的百粒干重從緩慢增加到持續極顯著增加，并在花后第49天達到最大值（1．0950g），較百粒鮮重最大值出現的時間延后19d左右，之后隨灌漿持續時間的延長，種子在株上進一步完熟發育，種子百粒鮮重繼續下降，百粒干重雖在開花49d后也有所下降，但下降程度不顯著，最后種子百粒干重基本穩定在1．0838g左右。在整個灌漿期間，種子脫水速率隨灌漿進程的遞進呈先快后慢的趨勢，種子含水量則持續下降，種子干重持續增加，至開花后55d種子干重趨于穩定，百粒干重在花后第49天達到最大1．095g，但含水量仍維持較高水平36．76%，開花52d后種子干重呈逐漸下降趨勢，至花后58d百粒干重達1．0687g，種子含水量下降至9．32%，種子含水量下降最快的時期為灌漿高峰結束期。以上結果說明唐古特大黃種子灌漿過程中，種子脫水速率的加快和干物質積累的穩定是種子成熟的重要標志，種子的最佳采收期應該在7月下旬，種子含水量在10%及以下為宜。

表3 唐古特大黃種子灌漿特性與發芽特性的相關分析Table 3 Relationship analysis of filling characteristics to germination trait of R． tanguticumplant seeds

種子的質量直接影響其田間出苗率，進而影響藥材的產量和質量，而種子發芽率、發芽勢和發芽指數是衡量種子質量的關鍵性指標，因此中藥材種植應該從種子質量的源頭抓起，才能更好地保障藥材的質量和產量［12］。石有太等［11］和米永偉等［22］研究表明，甘肅禮縣栽培3年的掌葉大黃種子灌漿充實過程中，開花36d后種子已具較高的發芽能力，種子內淀粉含量、可溶性糖含量和蛋白質含量均已穩定達到較高水平，但種子含水量較高，開花56d后種子含水量才下降到10%左右。本研究表明，在開花19d內采收的唐古特大黃種子可能由于其干物質積累量不足以滿足萌發過程中所需的能量，種子尚不具備萌發能力，花后第22天以后采收的種子隨灌漿持續期的延長種子的發芽勢、發芽率和發芽指數等發芽質量指標顯著提高，在花后第49天（7月19日）及以后采收的種子其發芽勢、發芽率和發芽指數均達到相對穩定高的水平，開花55d后種子含水量下降至10%以下。相關分析表明，種子百粒干重和灌漿持續期均與種子的發芽率、發芽勢和發芽指數呈極顯著正相關，而種子含水量與發芽質量各指標間均呈極顯著負相關，這與對掌葉大黃［21］和麻花秦艽［22］的研究結果相一致。大田觀察到灌漿末期唐古特大黃葉片與莖稈漸變黃時種子已成熟，此時種子含水率為10%左右，為適宜采收期，即開花55d（7月底）后莖稈尚未枯萎時采收為宜，由于株間和同株種子成熟均不一致，采收時需分批次及時采收，嚴防種子脫落損失。

致謝：甘南州科技局甘玉偉提供合作，甘肅農業大學碩士研究生齊浩參與田間試驗工作，2011級碩士研究生孫云波、農學院中草藥栽培與鑒定專業本科生陳宏觀、張萬世、何志鵬、陳高峰等參與部分實驗室試驗。

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