當歸新病害
——炭疽病病原鑒定及發病規律研究

卞靜，陳泰祥，陳秀蓉＊，王涵琦，楊小利，王艷，2

（1．甘肅農業大學草業學院，草業生態系統教育部重點實驗室，中－美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州730070；2．甘肅中醫學院藥學系，甘肅 蘭州730000）

當歸（Angelicasinensis）屬傘形科當歸屬，其干燥的貯藏根是我國一味常用中藥材，味苦、辛，性溫，藥用歷史悠久，在方劑中的應用頻度甚高，素有“十藥九歸”之稱［1］。由于其藥用價值以及保健價值得到了廣泛的認可，因此在全國范圍內的種植面積逐漸擴大，主產于甘肅、四川、云南等省，陜西、貴州、湖北等省也有生產，尤以甘肅的產量最大，年均種植5400hm2，總產量12000多噸，占全國總產量的70%以上，外銷量占全國總銷量的90%以上，國內銷售量占全國當歸總產量的70%以上［2］。

關于當歸病害國內報道有腐爛莖線蟲（麻口）病、根腐病、褐斑病、菌核病、銹病和白粉病6種［3－7］，近年來甘肅省由于種植面積擴大，病害逐年加重，其中當歸腐爛莖線蟲（麻口）病和根腐病已成為造成當歸產量下降，品質變劣的主要因素之一。2012年筆者在甘肅省當歸病害調查中發現，在甘肅省定西市渭源縣、岷縣、漳縣等當歸種植區，自7月初開始可見，在當歸植株的中、下部葉片干枯死亡現象較普遍，根據癥狀，初步認為可能是當歸炭疽病，但查閱資料，未見有關此病的報道。2013年經系統調查發現，8月初以后癥狀表現明顯，發病普遍，如渭源縣會川鎮發病率約為44%、漳縣大草灘約為55%、岷縣麻子川約為65%，至9月中旬則均達到100%，但各地不同地塊嚴重程度有差異，因此，筆者對其病害癥狀、病原特征、生物學特性以及發病規律、傳播方式及條件等進行了較系統的研究。本研究僅報道病害癥狀、病原學鑒定以及發病規律、傳播方式及條件等方面的研究，旨意為此病的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

1．1．1 供試培養基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH自然。

當歸汁液培養基：當歸葉10g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH自然。

馬鈴薯瓊脂蔗糖培養基（PSA）培養基：馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH自然。

察氏培養基：NaNO32g、KCl 0．5g、FeSO40．01g、K2HPO 41．0g、MgSO4·7H2O 0．5g、瓊脂15g、蔗糖30 g、蒸餾水1000mL。

1．1．2 供試儀器 主要儀器有NIKON光學顯微鏡，NIKON圖像分析系統，BI－2000圖像分析系統，Bioneer水平凝膠電泳裝置，Bioneer PCR熱循環儀，Bioneer凝膠成像系統，Biometra高速冷凍離心機，pHS－3C精密數顯酸度計、Apresys溫濕度記錄儀等。

1．1．3 供試試劑 主要試劑有Rnase，Proteinase K，PCR Master Mix，Marker購于上海生工生物技術公司，通用引物ITS1（5′－TCC GTA GGT GAA CCT GCG G－3′），ITS4（5′－TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC－3′）由上海生工生物技術公司合成。

1．2 試驗方法

1．2．1 采樣時間和方法 于2012年7，8月至2013年7，8月由甘肅省定西市渭源縣、漳縣、岷縣各當歸主產區調查發病率和嚴重度，同時進行癥狀描述，并采集典型病株，備用。

1．2．2 病原菌分離純化 采用常規組織分離法，將典型病株莖部切成0．4cm見方小塊，用1%的升汞消毒1 min，無菌水沖洗3次，分別置PDA、PSA、察氏和當歸汁液平板培養基上，每皿接種5塊，置25℃下培養7d后純化，編號，置4℃保存備用［8］。

1．2．3 致病性測定 當歸種子浸泡后，盆栽育苗，待植株長到約20cm高，并長出5個莖稈以上時，進行致病性測定［9－10］。采用針刺法接種，即用針輕輕刺傷健康的當歸植株的莖基部，將當歸汁液培養基培養的純菌種，配制成分生孢子濃度為3×106個／mL懸浮液澆灌于刺傷部位，用蘸滅菌水的棉球包在接種部位保濕，同時以刺傷健康植株澆灌無菌水后保濕作為對照，處理與對照均接種10株，保濕24h后，置于室溫下，每隔2d觀察其發病情況。待發病后對其病株進行鏡檢和再分離，并計算發病率。

1．3 病原菌的鑒定

1．3．1 病原菌的形態學鑒定 將分別在PDA、PSA、察氏和當歸汁液4種平板培養基保存的菌株轉接后，置25℃下培養，7d后觀察菌落性狀，鏡檢菌絲顏色、分生孢子盤、分生孢子形態，觀察是否產生剛毛，測量100個分生孢子及50個分生孢子盤的大小及剛毛的長度，并顯微拍照，根據病原形態、大小，查閱相關資料進行病原鑒定［11－12］。

1．3．2 病原菌的rDNA－ITS序列分析 將菌株轉接到PDA平板培養基上培養7d后，挑取菌絲塊接入PDA液體培養基中，置25℃，120r／min的恒溫振蕩箱培養7d，用滅菌的紗布過濾后，再用無菌水沖洗2～3次，然后用濾紙吸干水分，保存備用，參考張俊忠［13］的方法提取 DNA。參考相關文獻［14－17］，選擇ITS1（5′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3′）和ITS4（5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′）作為擴增引物，由上海生物公司合成引物。PCR反應在PCR擴增儀上進行，PCR反應體系為50μL，PCR反應條件為：95℃預變性3min，循環1次；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循環30次；最后72℃延伸10min。用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測。PCR擴增產物用上海生物公司提供的試劑盒進行純化，并由其對純化產物直接測序。將序列與GenBank中相關數據進行同源性分析，并構建系統發育樹。

1．4 發病規律研究

1．4．1 侵入途徑 盆栽當歸苗，選擇高約20cm，分支多于5個莖稈的健株用于試驗。將純培養的菌株配成濃度為3×106個／mL的菌懸液，分別采用針刺、灌根和噴霧3種方式進行接種，每處理10株。針刺接種：即用滅菌的細昆蟲針在莖基部輕微刺傷，將菌懸液澆灌于刺傷部位，用棉球蘸取無菌水保濕接種部位，同時以針刺莖基部，用無菌水澆灌刺傷部位并保濕的植株作為對照；灌根接種：即直接將菌懸液灌入根部，以無菌水澆灌的植株為對照；噴霧處理：即將菌懸液均勻噴灑于整株植物，并套塑料袋保濕，同時以噴無菌水同樣保濕植株為對照，以上處理均保濕24h后置于室溫下，觀察其發病情況，統計不同接種方式的發病率，確定該病原菌的侵入途徑。

1．4．2 田間發病進程 2013年在甘肅省渭源縣會川鎮新城村唐家灘發病田塊進行發病規律調查，自8月11日起，每7d定點調查1次，共調查7次，每次隨機調查100株，觀察發病進程，統計每株當歸植株莖稈的發病率及嚴重度，計算病情指數。病害分級標準，查閱相關資料［18］制定如下：0級：無病；1級：輕微發病，莖稈上有零星病斑，病斑面積占莖稈表面積的5%以下；3級：輕度發病，病斑面積占莖稈表面積的6%～50%；5級：中等發病，病斑面積占莖稈表面積的50%以上；7級：高度發病，50%以上的莖稈枯死發黑；9級：嚴重發病，整株枯死，并在莖稈上密生小黑點。

1．4．3 病害與溫、濕度的相關性 在發病規律調查田塊放置Apresys自記溫濕度記錄儀，設置每h記錄1次田間，自動測定田間小氣候溫、濕度變化情況，做出日均氣溫、濕度變化曲線，結合發病率及嚴重度調查結果進行回歸分析［19］，作出回歸方程，分析病害發生情況與田間溫濕度的相關性。

1．5 統計分析

采用Excel 2003和DPS 6．55軟件進行統計及方差分析。

2 結果與分析

圖1 病害癥狀Fig．1 Disease of symptoms

2．1 病害癥狀

2012年至2013年田間調查結果表明，此病一般在6月中、下旬開始發生，8月下旬到9月上旬達到發病高峰，該病害主要危害植株莖稈。如圖1所示，發病初期先在植株外部莖稈上出現淺褐色病斑，隨后病斑逐漸擴大，形成深褐色長條形病斑，葉片變黃枯死，莖稈從外向內逐漸干枯死亡，后期在病斑上出現黑色小顆粒，即病原菌的分生孢子盤，最后整株枯死。

2．2 致病性測定

挑選典型純化菌株（編號T1），針刺接種到健康的當歸植株20d后，植株均陸續開始發病，而對照未發病（圖2a）。鏡檢莖稈上的小黑點，均為已形成的分生孢子盤，與病株上的分生孢子盤形態一致（圖2b，c）。對發病植株進行再分離，獲得菌株的培養形狀、分生孢子形態與原接種菌株一致，因此可確定該菌株為致病菌。

2．3 病原菌的鑒定

2．3．1 病原菌培養性狀 分別在4種培養基上培養，菌落形態及顏色有差異，如圖3所示，在PDA、PSA和當歸浸汁液培養基菌落生長速度沒有明顯差異，菌落初期均為白色，后期在PDA上菌落變為黑色，在PSA上菌落變為黑褐色，在當歸汁液培養基上菌落則為白色，菌絲稀疏且產生大量灰黑色小顆粒，而在PDA、PSA培養基均未見小顆粒；在察氏培養基上菌落為白色，菌絲稀疏，生長速率明顯低于其他3種，也未見小顆粒。鏡檢培養的組織，在察氏和PDA培養基的組織，僅看到菌絲而未見分生孢子；在PSA培養基上雖能產生孢子但數量很少，未見分生孢子盤；僅在當歸浸汁液上鏡檢到大量的分生孢子，并且產生分生孢子盤，因此，當歸浸汁液培養基為病原菌生長的適宜培養基。

圖2 致病性測定Fig．2 Results of pathogenicity identification

圖3 不同培養基上的菌落形態Fig．3 Colonies on the different media forms

圖4 形態學鑒定Fig．4 Results of morphological identification

2．3．2 病原菌形態學特征 鏡檢和測量當歸培養基上的菌絲、分生孢子、分生孢子盤以及剛毛。結果表明，菌絲無色，有隔膜具分枝；分生孢子盤為黑褐色，大小為50～400μm，周圍有黑色剛毛，剛毛長度為45～200μm，頂端尖基部寬4～8μm，有0～7個隔膜；分生孢子有2種形態，一種孢子為新月形，兩端尖，無色透明，單胞，中間有一個油球，孢子大小為（18．0～24．5）×（3．5～5．0）μm，另一種孢子為卵圓形或橢圓形，無色透明，單胞，孢子大小為（9．7～16．5）×（2．5～4．0）μm（圖4）。查閱相關文獻資料［17］，初步確定該病病原菌為半知菌亞門腔孢綱黑盤孢目炭疽菌屬的束狀炭疽菌（Colletotrichumdematium，Grove）。

2．3．3 病原菌的rDNA－ITS序列分析 將菌株的PCR擴增產物測序、校對、剪切和拼接，獲得全長550 bp序列 （圖5）。將序列與GenBank中相關數據進行同源性分析，并構建系統發育樹（圖6），結果表明，該菌的ITS與已登錄的Colletotrichumdematium的ITS同源性均為99%。

圖5 PCR電泳檢測結果Fig．5 Electrophoresis results of PCR

綜合上述形態學和ITS序列鑒定，結果表明，甘肅省當歸炭疽病病原菌為束狀炭疽菌（Colletotrichum dematium，Grove）。

2．4 發病規律研究

2．4．1 侵入途徑 采用3種不同方式接種健株，15d后針刺接種的植株先發病，最初在莖部產生淺褐色病斑，后逐漸擴大形成深褐色條形病斑，葉片逐漸枯死，造成植株干枯死亡，莖部產生小黑點；18d后灌根的植株開始發病，癥狀與針刺接種的相同；20d后噴霧處理的植株開始發病，但發病率略低于其他兩種處理，癥狀同針刺接種的。30d后統計發病率，結果表明，針刺接種10株全部發病；灌根接種10株，8株發病；噴霧接種10株，5株發病；對照株均未發病（圖7）。以上結果說明，該病原菌可通過植物傷口、根部及地上部分自然孔口或直接侵入危害，傷口有利于病原菌的侵入。

圖6 T1菌株的rDNA系統發育樹Fig．6 rDNA phylogenetic tree of strain T1

圖7 室內盆栽傳播方式Fig．7 The mode of transmission of indoor plants

2．4．2 田間發病進程 6月調查時，田間僅有零星發病，但癥狀不典型，也未見病癥，不能確定為炭疽病危害所致。進入8月，出現典型癥狀后開始進行發病進程調查。由圖8可以看出，從6月開始發病到8月11日調查時，田間發病率和病情指數分別為44%和24%，隨后發病率穩定增長，9月1日，發病率已高達87%，僅僅20d的時間，發病率增長了43%，到9月15日發病率已達到100%；病情指數在8月11日至8月25日近半個月的時間增長了15%，而從8月25日到9月1日僅僅6d時間，病情指數高達68%，隨后病情增加緩慢，9月15日后病情指數不再增加，由此可見，8月11日至9月初是病害普遍發生時期，8月下旬病害嚴重度顯著加重，這與該時間段田間的溫濕度有一定的關系。

2．4．3 病害發生與溫度、濕度的相關性 經調查，試驗地塊的日均氣溫變化見圖9，夜間平均氣溫變化見圖10。由圖9可見，從8月13日至9月23日測定的43 d中，日均氣溫為10～27℃，夜間平均氣溫則為5～15℃。而在8月13日至9月1日中，發病率不斷增長時，白天日均氣溫為16～25℃，有利于病害的發生，與筆者測定病菌生長對溫度的要求一致。

圖8 田間發病進程Fig．8 The pathogenesis regularity in the field

經調查，試驗地塊的日均濕度變化見圖11，夜間平均濕度變化見圖12。在8月13日至9月23日調查的43d中，日均濕度高于90%的有27d，夜間平均濕度高于95%的共有40d，可見該地區相對濕度普遍高，有利于病害發生，特別是8月25日后，日、夜濕度明顯增高，日均濕度為87%～100%，而夜間平均濕度則均高達95%～100%，這與筆者測定的病原菌孢子萌發需要95%以上相對濕度相一致，此時濕度有利于病菌孢子的萌發和生長，加重了危害。

圖9 日均氣溫變化Fig．9 Changes of daily average temperature

圖10 夜間平均氣溫變化Fig．10 Changes of average temperature at night

圖11 日均濕度變化Fig．11 Changes of daily average humidity

圖12 夜間平均濕度變化Fig．12 Changes of average humidity at night

采用DPS 6．55軟件對當歸炭疽病的病情指數與平均氣溫、平均相對濕度等進行回歸分析。其相關性分別可用以下回歸方程表述：Y＝2．362X1－1．536，r1＝0．907；Y＝2．230X2－1．192，r2＝0．942。Y＝0．629X1＋0．746X2－22．976，r＝0．986。Y為病情指數；X1為平均氣溫；X2為平均相對濕度；r1為病情指數與平均氣溫的相關系數，r2為病情指數與平均相對濕度的相關系數。回歸分析表明，田間當歸炭疽病的病情指數與平均氣溫、平均相對濕度之間存在著極顯著的相關性。r為平均氣溫和平均相對濕度同時與病情指數的相關系數，因此從影響程度來看，病情指數受濕度影響大于溫度的影響，與室內生物學特性測定相一致。

3 討論

3．1 當歸炭疽病及其病原

查閱相關資料［20－21］，當歸屬植物的炭疽病在國外有報道，分別危害當歸屬中的白芷（Angelicadahurica）和川姜活（Angelicasylvestris），而當歸炭疽病在國內僅有1次簡單報道［22］，但其病原與本研究不是同一個屬，且未進行詳細的鑒定及研究，查閱其病原分子序列與Colletotrichumdematium沒有相似性，國外則未見報道。因此本研究系首次報道。據報道［23－25］，炭疽菌屬的成員寄主范圍廣，它們可寄生或腐生于不同科屬植物上，如束狀炭疽菌可侵染葡萄（Vitisvinifera）、蘿卜（Raphanussativus）、薯芋（Dioscoreagrandifolia）、大麗花（Dahliapinnata）、知母（Dahliapinnata）、枸杞（Lyciumchinense）、玉竹（Polygonatumodratum）、菠菜（Spinaciaoleracea）以及曼陀羅（Daturastramonium）等不同科屬植物，引起炭疽病。而Grove［27］報道，束狀炭疽菌僅寄生在枯死的莖稈和葉片，但本研究表明，將當歸炭疽病菌接種當歸健株，引起發病較重，田間調查亦表明，此菌危害當歸后，發病普遍且較重，可見此菌的致病性較強，與Grove［27］報道的有差異。另外，楊連娟和徐紅［28］報道，束狀炭疽菌在PDA上能夠產生大量孢子，并且相關資料表明，多種植物的炭疽病菌均可在PDA培養基上生長并產孢［28－31］。而本試驗菌株在當歸汁液培養基上產生大量孢子且產生分生孢子盤，在PSA培養基上僅能產生少量孢子，而在PDA不產孢。由此可見，本試驗的當歸炭疽病菌在致病性和生理特性上與其他寄生植物上有差異，此菌能否侵染其他植物，是否有生理分化還有待進一步研究。

3．2 侵入途徑

郭彩霞和遲曉紅［29］報道，萬年青炭疽刺盤孢菌（Colletotrichummontemartinii）接種14d后有傷口的葉片開始發病，17d后沒有傷口的葉片也開始發病，室內接種試驗比室外早2d。朱桂寧和蔡健和［30］報道山藥炭疽病病原菌（Colletotrichumgloeosporioides）也可侵入有傷口和無傷口的葉片。范永山和劉海英［31］等報道，唐山綠寶石炭疽病菌（Colletotrichumgloeosporioides）噴霧接種7d后開始發病。本試驗采用針刺、灌根和噴霧3種接種方式均能使健株發病，但針刺造成傷口有利于發病，與上述報道一致。因此，在田間進行農事操作時應盡量避免機械損傷，注意田間防蟲，以減少病害危害。灌根接種發病較重，說明該病原菌可以通過土壤帶菌，從根部或莖基部侵入。筆者在田間調查發現，重茬地的發病率高，這說明病菌可在田間病殘體上或土壤中越冬，造成土壤中病原菌積累，發病加重，因此，建議采取輪作倒茬、精耕細作、深翻土壤、清除帶病當歸殘體等措施。

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