植物抗旱基因工程研究進展

徐立明，張振葆，梁曉玲，盧文，張辰路，黃鳳珠，王雷，張素芝＊

（1.四川農業大學玉米所 農業部西南玉米生物學與遺傳育種重點實驗室，四川 成都611130；2.日照市五蓮縣農業局，山東 日照262300）

＊在自然條件下生長的植物，經常會面臨干旱、澇害、鹽堿、高溫、低溫、冷害、營養匱乏、重金屬污染等非生物脅迫，嚴重影響了植物的正常生長和發育。在這些逆境脅迫中，干旱是最為突出的限制因素之一［1－20］。近年來，基因工程的誕生使人類的農業生產史發生了巨大的變化。通過轉基因技術提高植物抗旱性，具備并已展現了巨大的應用價值和經濟價值，但其前提是必須了解植物抗旱的分子機制。植物受到干旱脅迫后會誘發植物體內其他多種不良反應，如活性氧爆炸、滲透壓的變化等，因而植物必須迅速啟動對這些不良反應的應答而存活下來（圖1）。干旱通常能觸發植物基因表達增強或減弱、代謝產物增加或減少、特異蛋白合成等應答活動［2，21－30］。此外，隨著基因芯片、數字表達譜、轉錄組等分子生物學技術的發展，多個干旱應答基因已被鑒定。這些鑒定的基因中，一些為調節基因，如編碼信號因子、轉錄因子的功能基因；一些為編碼功能性蛋白和有機分子合成酶的基因，如編碼合成調滲分子、多胺類分子，活性氧清除分子的功能基因；還有一些為編碼microRNA的功能基因。將這些干旱應答基因根據其作用方式轉化植物而增強抗旱性成為最佳策略［3－4，31－35］。本文著重從分子水平上闡述有關抗旱方面最前沿的研究，并且特別闡述了植物抗旱基因工程的發展近況。

1 信號分子

當逆境脅迫發生時，植物能通過各種不同的信號轉導活動，如蛋白的磷酸化和去磷酸化、對Ca2＋的感知、蛋白的降解等途徑對脅迫進行應答［4，36－47］。盡管這些復雜的信號途徑如何進行整體調控仍然不十分明確［5，48－63］，但是已有研究證實一些信號分子能通過參與干旱脅迫相關的信號轉導途徑，來調控植物抗旱性。例如，煙草（Nicotianatabacum）促分裂原活化蛋白激酶的激酶基因NPK1能夠調節干旱所誘發的氧化脅迫的信號轉導活動。在干旱條件下，過量表達NPK1的轉基因煙草比野生型生長狀況更好［6］。

通過激活因子或抑制因子調控信號轉導途徑，是植物應答干旱脅迫的一種主要方式。例如，擬南芥（Arabidopsisthaliana）的法呢基轉移酶ERA1作為負調節因子能抑制脫落酸（abscisic acid，ABA）信號轉導，從而降低擬南芥對干旱脅迫的耐受性。相反，反義抑制ERA1的轉基因擬南芥對ABA信號的應答增強，致使擬南芥的部分葉片氣孔關閉、蒸騰作用減弱、水分蒸發減少，最終表現為擬南芥抗旱性增強［7］。另外，激活因子能通過蛋白激酶正調控植物的抗旱途徑。在干旱條件下，擬南芥蛋白激酶SnRK2s（SNF1－related protein kinase 2）家族的9個成員（SRK2A－J／SnRK2.1－10）幾乎都被誘導表達［8］。其中，在正常的生長條件下SRK2C（SnRK2.8）低水平表達，但在干旱條件下SRK2C（SnRK2.8）被誘導激活，表達量顯著提高，擬南芥抗旱性增強［9］。此外，擬南芥中類SOS3的Ca2＋結合蛋白CBL（SOS3－like calcium－binding protein）與蛋白激酶CIPK／PKS能相互作用形成活性復合體，調控干旱、鹽或冷脅迫條件下的信號轉導活動。CBL1是CBL蛋白家族成員，在干旱條件下被誘導激活。轉基因擬南芥過量表達CBL1時，一些脅迫應答基因上調表達，擬南芥的抗旱性隨之增強［10］。

最近的研究發現一些信號調節因子通常參與多個信號轉導途徑的調控，如AtMPK6至少調節MKK2－MPK6和MKK4／MKK5－MPK6這2個不同的MAPK信號級聯活動，并且每個信號級聯活動都能夠傳遞或轉導不同的脅迫應答信息［11］，這說明了信號轉導網絡的復雜性。

圖1 在干旱脅迫下的遺傳路徑Fig.1 A genetic pathway under drought stress

2 轉錄因子

轉錄組分析發現，AP2、bZIP、NAC、MYB、Cys2／His2鋅指等不同類型的轉錄因子都能調控植物應答干旱脅迫（表1）［22－25，64－71］，這些轉錄因子通過激活或抑制下游干旱應答基因的表達，來調節植物的抗旱性［4，12，14，16］。

植物的bZIP轉錄因子能通過參與ABA信號轉導途徑調控植物對干旱脅迫的反應。在干旱條件下，植物體內ABA水平會有所增加，ABA信號轉導活動增強，一些干旱脅迫應答基因也被ABA誘導激活［13］。Fujita等［14］發現與 ABA順式作用元件 ABRE（ABA－responsive element）結合的蛋白 AREB（ABA－responsive element binding protein）屬于bZIP轉錄因子家族。這類基因如AREB1／ABF2、AREB2／ABF4和ABF3／DPBF5，能在干旱、ABA和鹽脅迫的誘導下增強表達，在擬南芥中過量表達時提高了植株對這些脅迫的耐受性［12，14］。

表1 應用轉錄因子的抗旱基因工程Table 1 Engineering of drought tolerance using transcription factors

R2R3－MYB類轉錄因子也參與了植物對干旱脅迫的調控。例如，MYB15在擬南芥中過量表達時，ABA合成相關的基因ABA1上調表達，擬南芥抗旱性隨之增強［15］。AtMYB60也是一個R2R3－MYB類轉錄因子，在擬南芥中能調控氣孔的開合。AtMYB60基因在擬南芥葉片保衛細胞中特異性表達，并在干旱條件下其表達受到抑制［16］。在干旱條件下，其功能缺失性突變體的部分氣孔關閉，蒸騰作用減弱，抗旱性增強。

水稻42個APETELA2（AP2）類轉錄因子分屬于6個亞家族（I－VI），能被不同的脅迫條件和ABA所誘導激活，其中亞家族I的AP37和亞家族Ⅱ的AP59能被干旱和高鹽脅迫誘導激活。啟動子OsCc1驅動AP37和AP59基因在水稻中過量表達時，對干旱脅迫表現出比野生型更強的耐受性。在嚴重的干旱條件下，過量表達AP37的轉基因水稻比過量表達AP59的轉基因水稻產量提高了16%～57%［17］。此外，DREB1／CBF（dehydration－responsive element－binding factors 1）也屬于 AP2類轉錄因子［18－19］。在干旱、鹽、冷的脅迫條件下，擬南芥DREB1／CBF上調表達，致使擬南芥對這些脅迫的耐受性增強［19］。用脅迫誘導型啟動子Atrd29A驅動At－DREB1A／CBF基因表達的轉基因花生（Arachishypogaea），能比野生型合成更多的抗氧化酶（antioxidant enzymes）和脯氨酸，表現出更強的抗旱性［20］。Dubouzet等［21］從水稻中也分離出4個與擬南芥DREB1A／CBF同源的水稻基因OsDREB1A、OsDREB1B、OsDREB1C和OsDREB1D。在水稻中過量表達OsDREB1時，轉基因株系對干旱、鹽和冷脅迫耐受性增強。

NAC類蛋白是植物中另一類重要的轉錄因子，能調控植物的生長發育和增強植物對脅迫環境的適應能力。ANAC019、ANAC055和ANAC072是從擬南芥中分離到的3個不同的NAC基因，在干旱條件下這些基因被誘導激活。在擬南芥中過量表達這些基因時，轉基因株系的抗旱性增強［22］。在水稻中也分離到NAC類型的轉錄因子，如SNAC1能被干旱脅迫所誘導，過量表達SNAC1的轉基因水稻抗旱性比野生型明顯地增強［23］。

除此之外，一些鋅指轉錄因子（如STZ）能通過負調控基因表達而增強植物抗旱性。在擬南芥中，受干旱、高鹽、冷等脅迫條件的誘導，編碼C2H2型鋅指轉錄因子的STZ基因上調表達。同時，過量表達STZ基因的轉基因擬南芥抗旱性增強［24］。此外，在擬南芥中過量表達STZ的直系同源基因CAZFP1時，除了能增強擬南芥抗旱性之外，抵御病原菌侵染的能力也增強［25］。

3 滲透調節小分子物質

在水分匱乏的情況下，植物為抵御干旱脅迫，細胞內可以大量合成甜菜堿（glycine betaine，GB）、脯氨酸（proline）、海藻糖（trehalose）、甘露醇（mannitol）等滲透性的有機小分子物質，增加細胞的滲透勢，縮小與周圍環境的滲透勢差，從而使植物避免因高滲透勢差導致細胞過度失水死亡［26］（表2）。

植物可通過大量合成甜菜堿來應答干旱脅迫［27］。在高等植物里，膽堿單加氧酶（choline monooxygenase，CMO）和甜菜堿醛基脫氫酶（betaine aldehyde dehydrogenase，BADH）是GB生物合成的2個關鍵酶。在煙草中過量表達COM基因時，能導致甜菜堿高水平的積累和煙草抗旱性的提高［28］。

與GB類似，脯氨酸也是一種重要的滲透調節分子。脯氨酸是水溶性很強的氨基酸，它的疏水端與蛋白質聯結而親水端與水分子結合，從而使得蛋白通過脯氨酸能束縛更多的水分子，因此提高脯氨酸的合成能力能夠增強植物的抗旱性。吡咯啉－5－羧酸鹽還原酶（pyrroline－5－carboxylate synthetase，P5CR）是脯氨酸生物合成的一個關鍵酶［29］。P5CR基因在大豆（Glycinemax）、矮牽牛（Petuniahybrida）和煙草里已經被鑒定，并且發現幾乎所有的轉化P5CR基因的植物都表現出脯氨酸的過量積累并伴隨其抗旱性的增強［30－31］。

海藻糖也是一個重要的滲透調節因子，轉化海藻糖生物合成的關鍵酶基因能提高植物的抗旱性。例如，轉化大腸桿菌海藻糖－6－磷酸合成酶（trehalose－6－phosphate synthase）TPS1基因能使海藻糖在轉基因煙草體內大量積累，同時伴隨其抗旱性的增強。轉基因煙草還呈現出植株矮小、葉片呈柳葉刀型等抗旱性表型［32］。此外，過量表達酵母TPS1－TPS2融合基因的煙草比野生型的抗旱性更強，而且比僅過量表達TPS1的煙草在干旱條件下表現出更好的生長狀況［33－34］。另外，用脅迫誘導型啟動子rd29A驅動大腸桿菌海藻糖合成的調控基因otsA、otsB與海藻糖－6－磷酸合成酶的磷酸化酶（trehalose－6－phosphate synthase phosphatase）基因TPSP在水稻中融合過量表達時，此融合基因otsA－otsB－TPSP僅在脅迫條件下被誘導激活，隨后轉基因水稻體內的海藻糖能大量積累，對干旱、高鹽等非生物脅迫的耐受性也隨之提高［35－36］。

甘露醇也參與了滲透調節干旱脅迫。小麥的甘露醇－1－磷酸脫氫酶（mannitol－1－phosphate dehydrogenase）基因mt1D過量表達時，轉基因小麥體內的甘露醇含量增加，對干旱和鹽脅迫的耐受性增強［37］。然而，將大腸桿菌的mt1D基因導入煙草時，雖然在轉基因煙草體內甘露醇也有積累，但轉基因煙草對脅迫的耐受性并未隨之提高［38］。據此，在通過轉化甘露醇生物合成相關基因提高植物的抗旱等脅迫的基因工程開始前，需首先確定這些基因是否與干旱等脅迫耐受性相關。

表2 應用有機滲透分子的抗旱基因工程Table 2 Engineering of drought tolerance using organic osmolytes

4 活性氧清除分子

經研究發現，干旱通常會導致植物體內活性氧（reactive oxygen species，ROS）如 O22－、O、H2O2、OH－等過量積累。高等植物具有ROS的清除系統，包括一些抗氧化酶，如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、抗壞血酸超氧化酶（ascorbic acid oxidase，APX）、過氧化氫酶（catalase，CAT）和一些抗氧化的小分子，如抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、維生素 E等［39，42］。通常植物體內 ROS清除系統能將ROS轉換為無氧化活性的化合物，使ROS得以清除，從而避免細胞膜脂的過氧化、新陳代謝酶類的氧化失活。

在干旱條件下，植物過量表達SOD和APX基因時，對干旱誘發生成的過量H2O2和O22－清除能力增強，轉基因植物表現出抗旱性增強。例如，過量表達葉綠體MnSOD基因的轉基因水稻比野生型表現出更強的抗旱性［41］。受干旱條件誘導，豌豆APX基因的轉錄水平提高，此時豌豆體內的APX含量和活性都有所增加，呈現出抗旱性增強的表型［42］。此外，用脅迫誘導型啟動子rd29A驅動高羊茅（Festucaarundinacea）的APX－Cu／Zn－SOD融合基因在葉綠體里過量表達時，能有效地減輕干旱等脅迫條件所導致的氧化損傷，致使高羊茅抗干旱等脅迫的能力增強［43］。

植物體內CAT活性的強弱與植物受脅迫的程度相關。Luna等［44］研究發現，在輕度的干旱脅迫條件下，煙草CAT的活性很低，但是在嚴重的干旱條件下CAT的活性增強。一些研究發現在嚴重干旱條件下，過量表達大腸桿菌CAT基因的轉基因煙草比野生型具有更強的抗旱性［45］。而且，研究還發現APX和CAT缺失的雙突變體煙草能通過抑制光合作用和提高參與磷酸戊糖途徑的基因、單脫氫抗壞血酸還原酶（monodehydroascorbate reductase）基因的表達水平，來緩解和降低干旱誘導的過量ROS對其造成的傷害，從而增強其抗旱性［46］。

抗氧化小分子的積累也能提高植物的抗旱性。例如，擬南芥和結縷草（Zoysia）能通過積累AsA／GSH和維生素E，清除體內的OH－和O22－，減輕ROS所造成的損傷，使其在干旱條件下能夠正常的生長和發育［47－48］。此外，西瓜（Citrullus）還能通過積累瓜氨酸和金屬硫蛋白來調節體內的OH－和O22－的水平，使體內的蛋白和DNA免受ROS的氧化損傷，使西瓜的抗旱性增強［49－50］。

5 多胺類分子

植物能通過積累多胺類化合物（polyamines，PAs），如腐胺（putrescine，Put）、亞精胺（spermidine，Spd）、精胺（spermine，Spm），來應答干旱、冷、熱、重金屬等逆境脅迫。然而，這些PAs應答脅迫的分子機制仍然不明確，因此分析增加的PAs的水平是脅迫誘導的結果或脅迫應答的結果十分必要［51－52］。

最近，通過對功能獲得性和功能缺失性突變體的研究，證實了PAs具有應答干旱等非生物脅迫的功能［53］。通過對不同植物調控PAs合成的基因ADC、SAMDC等進行異源表達，發現這些基因能響應干旱等非生物脅迫。擬南芥S－腺苷甲硫氨酸脫羧酶（S－Adenosyl methionine decaboxylase）SAMDC1基因過量表達時，轉基因株系體內的Spm水平升高，對干旱、鹽等非生物脅迫的耐受性增強。同時，SAMDC1基因過量表達時，還能使ABA生物合成基因NCED3（9－cis－epoxycarotenoid dioxygenase）上調表達，轉基因株系體內的ABA水平增加，ABA信號轉導途徑增強，抗旱性也隨之顯著增強，說明Spm能與ABA協同提高植物對干旱的耐受性，但Spm合成水平是否與ABA信號途徑有關尚無報道［54］。此外，在擬南芥中過量表達ADC2（arginine decarboxylase 2）基因時轉基因株系體內的Put水平增加，擬南芥的抗旱性也隨之增強［55］。另外，對調控PAs生物合成相關基因的功能缺失性突變體進行研究，也證實了PAs調控植物應答干旱等非生物脅迫的功能。例如，擬南芥T－DNA插入突變體adc2對干旱高度敏感［56］，突變體acl5／spms（不能合成Spm）對干旱和鹽脅迫高度敏感。但是，在施加外源的PAs時，這些突變體對逆境脅迫的敏感表型能部分恢復。

6 小RNA分子

植物能編碼、剪切和積累21～24個核苷酸左右的小RNAs［57］，基于不同的生成機制可將其分類為miRNAs（microRNAs），ta－siRNAs（trans－acting siRNAs），nat－siRNAs（natural antisense siRNAs）和ra－siRNAs（repeatassociated siRNAs）。這些小RNAs通過對目的mRNA的降解、翻譯活動的抑制和染色質的修飾，調控目的基因的表達［58］。

通過高通量的生物技術（如基因芯片）對干旱條件下植物進行轉錄組分析，除發現了大量的差異表達基因，還發現miRNAs的表達也存在差異［58－60］。例如，在干旱條件下，擬南芥通過上調表達miR157、miR167、miR168、miR171、miR408、miR393、miR396、miR319和 miR397應答干旱脅迫［58，61］。但是，三角葉楊（Populustrichocarpa）miR1446a－e、miR1444a、miR1447和 miR1450在干旱條件下表達水平下調，并且 miR1711－a、miR482.2、miR530a、miR827、miR1445和miR1448的表達也輕度下調來應答干旱脅迫［62］。此外，在干旱、鹽等非生物脅迫條件下，菜豆（Phaseolusvulgaris）能通過輕度上調表達miR2118，適度上調表達miR159.2、miR393和miR1514應答干旱等非生物脅迫［59－60］。這些研究表明，在干旱脅迫下，植物能通過上調或下調表達特異的miRNAs而增強對干旱等脅迫的耐受性。

7 展望

目前，一些應答干旱脅迫的基因已經被鑒定，一些重要的基因已經通過轉基因技術成功地改善了植物的耐旱性?；蛐酒?、數字表達譜、轉錄組等高通量生物技術的應用使得抗旱相關的候選基因的鑒定進一步加快，這為植物抗旱基因工程的研究提供了強大的技術支持。同樣，運用最前沿的基因工程技術轉化抗旱性的基因，這對于發現新的抗旱相關的基因，并且研究其功能具有重要意義［4］。然而，目前植物抗旱基因工程的研究僅僅是一個開始，在植物抗旱性的研究中還存在很多的問題［5，12，26］?？购凳怯啥嗷蚩刂频臄盗啃誀?，其生理生化過程是各基因間以及基因和環境間相互作用、共同調節的結果。植物抗旱分子機制十分復雜，了解還不夠全面深入，基因轉化獲得抗旱性植株還有很大的盲目性，因而必須加強對抗旱分子機制的研究。植物轉入單基因提高植物的抗旱性對有的基因和植物有效，對有的基因和植物卻無效，然而植物轉入復合基因能夠更好地提高植物的抗旱性，但這方面的研究在先前的報道中很少，可能是多個外源基因的滲入給植物帶來比較多的副作用［26］。為了避免給植物生長和發育帶來影響，了解候選基因在植物生長不同的時期和不同的部位表達也是轉基因技術中一個必須考慮的因素。轉基因的過量表達體系中普遍應用的組成型表達啟動子，如CaMV35S啟動子，并不適用于每一個物種，并且消耗太多的植物能量而影響植物生長和發育。對于植物應答脅迫而不消耗太多的植物能量，脅迫誘導特異型啟動子是一個不錯的選擇。轉基因植物的研究，通常在實驗室受控的環境條件下，而田間的生長環境多樣性，植物可能要在多種脅迫的環境條件下生存，成功地在田間運用轉基因技術增強植物對多種脅迫環境的抗性還需要進一步的研究。因此，深入研究各種脅迫之間的相互關系是非常重要而且必要的［26，63］。

最近的研究常常關注一些調節因子響應脅迫應答的機制。一些重要的脅迫應答調節因子，通常彼此之間相互作用并且具有內在的相互關系，如一些信號因子和轉錄因子能夠廣泛地調控植物應答脅迫［63］，但其之間的相互關系十分復雜。近來，分子系統學和基因組學的分析已使復雜的基因調節網絡變得更加清晰，并且輔助發現了一些新的脅迫應答因子和脅迫應答調節機制，這些進步使得利用基因工程技術改善植物抗旱性能獲得更好的結果。此外，一些新的基因工程的研究領域，如功能性蛋白、調控元件和RNA調節，在未來也將凸顯出它的重要性［4－5］。因此，根據不同的植物生長發育周期和環境條件，運用基因工程技術改善植物抗旱性將擁有越來越好的前景。

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