模擬酸雨與Cd對紫萼膜脂過氧化及形態特征的影響

王成聰，高素萍，黃麗，林嘯，張碩，雷霆

（1.四川農業大學風景園林學院，四川 成都611130；2.四川農業大學園林研究所，四川 成都611130）

＊植物是城市污染物的一個重要的匯［1］。快速城市化導致城市污染加劇，城市植被生態服務功能下降。研究城市環境與城市植被間的相互作用，特別是城市環境污染對城市植被的生態脅迫效應已顯得尤為重要。自然狀態下，絕對意義上的單一污染是不存在的，污染多具伴生性和綜合性［2］，各因素間可能會產生加和、協同或拮抗等作用。酸雨可以影響土壤中重金屬的化學行為，二者共同導致植物生存條件進一步惡化［3］。雖然目前酸雨和重金屬污染對植被生態脅迫效應的研究已得到充分重視，但多數研究集中在單一酸雨或重金屬對植被的脅迫方面，且局限于單因素水平變化產生的表面效應。酸雨與重金屬復合污染的研究主要集中于農作物方面，且并不區分各脅迫因子對總體脅迫效應的貢獻程度［4］。

紫萼（Hostaventricosa）是百合科玉簪屬多年生草本植物，生物量大且易于繁殖和養護，已在城市綠化中推廣應用。目前，紫萼的相關研究主要集中在Pb脅迫［5－6］方面，有關Cd和酸雨單一或復合污染對紫萼影響的相關研究尚未見報道。那么，在酸雨與Cd復合污染的共同作用下，紫萼植株體內的膜脂過氧化及形態的變化特征，以及這種變化到底是酸雨與Cd傷害效應的簡單加和，還是二者協同或拮抗作用所致尚不得而知。基于這樣的假設和疑問，人工模擬酸雨與重金屬Cd的復合污染條件，研究其對紫萼植株形態特征與膜脂過氧化方面的影響，比較單一與復合污染對植物的不同影響，確定二因素間的相互作用類型，并區分各脅迫因子對總體脅迫效應的貢獻程度，討論引起表面效應的微觀過程，找出引起植物受害的污染強度閾值，以期為城市綠化凈化植物材料選擇與城市植被生態系統修復等實踐提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗材料選擇三年生紫萼實生苗，為2010年3月種子萌發所得，種子采自雅安市碧峰峽大熊貓基地。選取其中長勢良好且基本一致的實生苗，于2012年10月提前轉移至四川農業大學成都校區苗圃順利越冬。

1.2 配制盆土

將采集的土壤（園土）和腐殖土自然風干，碾碎并剔除雜物后進行研磨，過5mm篩，二者按比例1∶1混合均勻，用80%多菌靈1000倍液消毒，密封堆放30d備用。混合土基本理化性質如下：pH值6.5，Cd背景含量為0.466mg／kg，全氮（N）0.68g／kg，全磷（P）0.55g／kg，全鉀（K）3.24g／kg，有機碳（C）36.49g／kg，陽離子交換量（CEC）17.83cmol／kg。

1.3 外源Cd處理

根據國家土壤環境質量標準和成都平原重金屬污染情況，并通過一系列預試驗，最終確定盆土5個Cd濃度梯度分別為0，10，30，50，100mg／kg（以Cd2＋離子含量計）。其具體配制方法如下：用分析天平稱取20.3149g分析純試劑CdCl2·2.5H2O，用超純水（RO）定容至1L的容量瓶配成母液備用。處理時，用量程為5000μL的移液槍分別吸取母液0，1000，3000，5000，10000μL，定容至5個200mL的容量瓶中，制成每瓶分別含有0，10，30，50，100mg的Cd污染處理液（以Cd2＋離子含量計）。由于試驗中每盆稱取的混合土重為2kg，故每個梯度濃度的Cd處理液需重復噴淋加入1次。其中，以不添加Cd2＋的土壤作為對照（CK）。

1.4 模擬酸雨處理

模擬酸雨溶液的配制參照麥博儒等［7］的方法并加以改進，根據成都市溫江區氣象局提供的氣象觀測資料，參考成都市近年來的降水主要離子組成及濃度［8］，同時考慮到自然降水離子濃度的不確定性以及試驗的可操作性，通過計算最終確定模擬酸雨溶液中各主要離子濃度（表1）。

表1 模擬酸雨各主要離子成分Table 1 Main ion concentrations of the mixed simulated acid rain μmol／L

精確稱取分析純試劑CaCl2（1.6225g）、（NH4）2SO4（1.0228g）、MgSO4·7H2O（0.6581g）、KNO3（0.3508 g）、NaF（0.1122g），用超純水分別定容至100mL容量瓶制成濃溶液，用量程為1000μL移液槍分別吸取濃溶液1mL，再用超純水分別定容至100mL容量瓶作為稀釋液，然后將5種稀釋液依次加入1L容量瓶中混勻，用超純水定容至刻度線；再以0.05mol／L稀鹽酸溶液進行pH 值分別為6.5，5.5，4.5，3.5，2.5的標定，即為試驗所用的模擬酸雨處理液。CaCl2和稀鹽酸的加入也意味著有一定數量的Cl－加入，但每次噴施的Cl－總量（10－6mol數量級）與土壤中Cl－相比較少，且低濃度Cl－不會對植物產生毒害作用。各處理離子組成濃度最終以ICS－2100離子色譜儀（DIONEX，Sunnyvale，USA）測定為準。

酸雨的臨界pH為5.6，各酸雨梯度pH 分別模擬極強酸雨（extreme AR，pH＝2.5）、強酸雨（strong AR，pH＝3.5）、較強酸雨（moderate AR，pH＝4.5）、弱酸雨（weak AR，pH＝5.5）以及對照（CK，pH＝6.5）。用小型噴霧器仿照自然降水，每隔3d分別噴淋1次各pH模擬酸雨溶液，每次每盆100mL。

1.5 試驗方法

試驗采用二因素五水平完全隨機試驗設計，共25個處理組合（表2）。每個處理組合重復3次，即75盆，每盆栽2株，共150株紫萼。

2013年3月28日，隨機選擇長勢良好且相近的三葉期紫萼，剪去腐爛的根系，用清水沖洗干凈后蘸取80%多菌靈800倍液消毒后，栽植于20cm×15cm×15cm盆中，每盆稱取2kg混合土。花盆下襯墊托盤，將土壤滲出液倒回盆內，以防止土壤中重金屬Cd流失。分株15d后，待苗木長勢恢復良好后即開始試驗處理。大棚內外溫濕度基本一致，遮陰網遮光率為85%。

表2 Cd和模擬酸雨復合處理組合Table 2 The treatment combination of Cd and simulated acid rain

1.6 指標測定

處理30d后，測試鮮樣隨機采自每個處理植株的第3～5片葉，采用打孔法從每株紫萼取3個樣本來進行各生理指標的測定。由于紫萼葉片可見傷害的出現明顯滯后于其他生理指標，故該指標的測定安排到試驗的后期進行，以印證試驗前期各生理指標對Cd和酸雨復合污染的響應，具體取樣時間為處理后的第60天。

1.6.1 可見壞死百分比 葉片圖像由數碼相機Canon IXUS 130拍攝，葉片壞斑點的總面積以及總的葉面積均由軟件Adobe Photoshop 3.0統計，可見壞死百分比表示為壞死面積與總葉面積的百分比，詳見肖強等［9］的方法。

1.6.2 MDA和ROS（活性氧）含量 MDA測定參照李合生［10］的方法。H2O2測定參照Patterson等［11］的方法；測定采用高俊鳳［12］的方法。

1.6.3 SOD和CAT活性 SOD活性測定采用NBT光還原法［10］；CAT活性測定采用紫外吸收法［10］。

1.7 數據處理

用SPSS 20.0軟件進行數據分析。采用兩因素方差分析（Two－way ANOVA）檢驗處理的顯著性；用LSD法進行處理間多重比較；用Pearson相關分析法來評價相關顯著性。用Microsoft Excel 2010制作圖表。

2 結果與分析

2.1 模擬酸雨與Cd復合脅迫對紫萼植株形態的影響

如圖1，單一酸雨下，pH≥4.5時紫萼葉片幾乎沒有傷害癥狀；pH在2.5～3.5時，葉片才出現受害癥狀，雖與對照差異達到顯著水平（P＜0.05），但受害面積都在5%以下，說明紫萼是一種對酸雨抗性較強的植物。單一Cd處理下，濃度30mg／kg是一個轉折點，開始出現明顯的可見傷害，可見壞死百分比隨Cd濃度增加而增大，處理間差異均達到顯著水平（P＜0.05）。通過對主效應和交互作用進行分析可知，酸雨與Cd交互作用顯著（P＜0.05），更多地表現為協同作用。這種傷害作用在酸雨pH≥4.5以及Cd濃度≤30mg／kg水平下并不明顯，在酸雨pH≤3.5以及Cd濃度≥30mg／kg水平下，這種傷害明顯大于兩因素各水平傷害的簡單加和。Cd是本試驗中造成葉片壞死的主要貢獻者，酸雨pH＝2.5和Cd濃度30mg／kg是對紫萼造成可見傷害的臨界值。

圖1 模擬酸雨與Cd復合污染對紫萼葉片的可見傷害以及對MDA含量的影響Fig.1 Combined effects of Cd and Simulated acid rain on the visible damage and the MDA content in leaves of H.ventricosa

2.2 酸雨與Cd復合污染對紫萼質膜過氧化的影響

圖2 模擬酸雨與Cd復合污染對紫萼ROS產生量的影響Fig.2 Combined effects of Cd and simulated acid rain on the ROS content in leaves of H.ventricosa

2.3 模擬酸雨與Cd復合污染對紫萼抗氧化酶活性的影響

總體來看，隨Cd和酸雨污染強度的增加，紫萼葉片中SOD和CAT活性變化趨勢明顯，都表現為先增加后下降的趨勢（圖3）。單一酸雨下，隨pH的下降，SOD和CAT活性明顯增加，pH為3.5和2.5時處理差異顯著。單一Cd處理下，SOD和CAT活性隨Cd濃度的增加都呈單峰型曲線，CAT活性達到峰值的濃度為30mg／kg，低于SOD的50mg／kg，說明CAT活性對Cd污染更為敏感。復合處理下，酸雨pH≤5.5時SOD活性在Cd濃度為30mg／kg處即達到最大值；在pH為6.5時，SOD活性在50mg／kg處達到最大值。酸雨和Cd兩因素間交互作用顯著，Cd是造成葉片紫萼葉片中SOD和CAT活性變化的主要因素。

圖3 模擬酸雨與Cd復合污染對紫萼SOD和CAT酶活性的影響Fig.3 Combined effects of Cd and simulated acid rain on the SOD and CAT activity in leaves of H.ventricosa

3 討論

葉片可見傷害是逆境脅迫危害的最直觀證據。紫萼對酸雨有一定的耐受性，只有在強酸雨下才表現出較輕的可見傷害，這與 Chen等［13］對木荷（Schimasuperba）與楓香（Liquidambarformosana）的研究結果一致。在Cd的復合作用下，酸雨與Cd產生了協同作用，加重了對紫萼葉片的傷害，但Cd濃度較低時可見傷害仍不明顯。酸雨pH＝2.5和Cd濃度30mg／kg是對紫萼造成可見傷害的臨界值，生理指標的這一臨界值會提前顯現，說明生理指標對復合污染指示更為靈敏。

植物細胞質膜是細胞與外界進行物質能量交換的界面，逆境脅迫對植物的傷害首先作用于質膜，產生對細胞質膜有害的ROS。植物的受害程度與ROS積累密切相關，ROS過量積累會導致質膜過氧化加劇［14］。隨污染強度的增大，O2－·產生速率、H2O2含量隨之顯著升高，與Cd濃度呈極顯著正相關，表明高強度復合污染加劇了紫萼體內自由基的量態，使植物遭受到更嚴重的傷害。Cd能使光呼吸系統功能紊亂，導致活性氧的產生，還可誘導NADPH氧化酶活性提高，促進NADPH氧化，致使ROS大量生成［15］。

ROS產生量的變化情況，與SOD和CAT活性變化密切相關。正常情況下，植物體內有一套完整的ROS清除系統，抗氧化酶是其重要組成部分。在遭受外界逆境的脅迫時，抗氧化酶能將ROS的產生與清除維持在較低的動態平衡狀態，從而防止逆境脅迫對植物造成的ROS傷害。SOD是植物體內ROS防御系統的第一道防線，能催化超氧陰離子自由基歧化反應成為基態的分子氧和H2O2，并與CAT共同組成ROS防御酶系統［16］。如圖3，正常紫萼體內SOD活性較穩定，ROS的產生與SOD的清除維持在動態的平衡狀態。紫萼在遭受較弱酸雨與Cd復合污染時，隨著脅迫強度的增加，體內產生的ROS會誘導SOD活性上升，從而大大增加了SOD對ROS的歧化能力，有效地清除ROS并防止逆境脅迫傷害。而當脅迫強度超過植物的耐受限度時，SOD活性便開始下降，CAT可以將H2O2催化分解為H2O和O2，其活性變化對植物體內膜脂過氧化平衡起著重要作用。圖3的CAT活性變化表明，當脅迫強度較小時，CAT酶活性被激活，有效地清除了紫萼體內ROS代謝產生的H2O2；而當脅迫強度較大時，CAT活性嚴重受到抑制，并呈現出逐漸下降的趨勢，最終導致H2O2的過量積累，對紫萼產生毒害作用。H2O2可以和過量的O2－·生成毒性更強的·OH，對植物造成更嚴重的傷害［17］。從SOD和CAT酶活性峰值出現位置來看，CAT對復合污染的敏感性明顯高于SOD。

當植物體內ROS含量過多而不能及時被ROS防御酶清除掉時，便會導致ROS的逐漸積累，進而引發一系列膜脂過氧化反應，最終表現為質膜透性的變化［18］。MDA是一種高活性的脂質過氧化最終分解產物，能交聯脂類、核酸、糖類及蛋白質，導致細胞質膜受損［19］。如圖2，酸雨強度較大時，可以顯著地促進膜脂過氧化反應，導致MDA含量上升。Cd含量與MDA含量呈極顯著的正相關關系，這表明MDA含量可以很好地指示紫萼葉片細胞的脂質過氧化程度。氧自由基參與膜脂脫脂作用，在強氧化劑H2O2的作用下，通過Habe－weiss反應產生攻擊力更強的·OH，啟動膜脂過氧化，最終造成MDA含量增加［20］；或是因為ROS破壞生物功能分子如氨基酸、蛋白質、糖類，最終引起膜的過氧化作用，導致MDA含量增加［21］。試驗中MDA含量的變化，可與O2－·產生速率、H2O2含量變化相互印證。

4 結論

1）酸雨和Cd復合污染比單一因素污染對紫萼造成的傷害大，二者間存在明顯的交互作用，并非簡單的加和作用，更多地表現為協同作用，高強度復合污染對紫萼的影響更大。2）紫萼對酸雨和Cd脅迫有較強的耐受性。相比而言，重金屬Cd是復合污染下造成植物傷害的主要因素。3）酸雨pH＝2.5和Cd濃度30mg／kg是造成植物可見傷害的臨界值，且生理指標比形態指標更為敏感，CAT活性對Cd污染脅迫響應比SOD敏感。

總之，無論是復合污染還是單一污染，紫萼都表現出較好的耐受性，出現一個明顯的耐受閾值。這為酸雨與Cd復合污染地區的植物生態修復提供了一些可供參考的依據。

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