通過增加痰液量和超聲裂菌提高結核分枝桿菌熒光定量PCR檢出率

張 軍，王曉飛，王瑞東，韓 敏，景玲杰，陳 晉

(同濟大學附屬上海市肺科醫院檢驗科，上海200433)

肺結核病的實驗室診斷主要依賴痰涂片和培養，由于涂片的陽性率低，培養的時間長，這些應用都無能完全滿足臨床診斷的需求。近年來，分子診斷最為一種快速診斷的手段，在國內實驗室得到廣泛的開展，其中熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測結核分枝桿菌DNA是1種常見的手段，目前國內市場上有達安基因、凱杰生物、科華生物等多家廠家提供熒光定量PCR檢測試劑盒。國外市場上類似的產品有羅氏公司的Amplicor Cobas?MTB 檢測系統[1]，BD 公司的 BD Probe-TecTMET MTB System[2]和 Cepheid 公司 Gene Xpert?MTB/RIF[3]等產品。文獻報道發現，國內熒光定量PCR在確診結核患者的陽性檢出率在55.28%左右[4]，而國外公司的產品的陽性檢出率在80% ～100%范圍內[3]，遠遠高于國內的產品。除了產品設計的原因之外，如何有效的進行結核桿菌DNA的提取是影響最終檢出率的重要因素。對此，國內外實驗室都有了一些有益的探索[5]。

我們實驗室常規采用凱杰生物公司的結核分枝桿菌熒光定量PCR檢測試劑盒進行痰液的結核菌DNA定量檢測。為了提高結核桿菌的臨床檢出率，我們主要采用了增加痰液量和超聲破碎的方法來提高痰液標本的結核菌陽性檢出率。在幾乎沒有增加實驗成本的情況下，取得了非常好的效果。

材料和方法

一、患者的選取

選取上海市肺科醫院2012年3月～2013年2月的疑似結核病初診患者，疑似患者主要根據臨床癥狀、體征及胸部X線或者CT表現。所有患者進行痰涂片、培養和熒光定量PCR檢測結核菌。最終有206例臨床確診為肺結核病例作為我們的研究對象，其確診標準為同時滿足以下3個條件:(1)有臨床癥狀、體征和X線或者CT表現;(2)痰培養陽性并鑒定為結核分枝桿菌;(3)臨床抗結核治療有效。另有103例確診為非結核患者，主要為細菌性肺炎、支氣管擴張癥以及慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者。

二、試劑和儀器

4%NaOH本實驗室自行配制。染色液:金胺“0”1 g溶于95% 乙醇100 mL中，加5% 石炭酸液900 mL混勻即可。脫色劑:3%鹽酸酒精。復染劑:高錳酸鉀0.5 g，溶于100 mL蒸餾水。結核分枝桿菌熒光定量PCR試劑盒由凱杰生物公司提供。儀器為ROCHE LightCycler 480熒光定量PCR儀(Roche公司)。MGIT 960結核菌液體快速培養系統(美國BD公司)。

三、痰標本的收集

收集痰標本之前，患者需刷牙、漱口，并深咳后留痰。患者常規留取3次痰涂片。痰培養的痰液量為2～5 mL。熒光定量PCR留取的痰液量為5～10 mL(留取時間為24 h之內，累積收集)，采用50 mL的尖底無菌離心管收集痰標本。

四、痰涂片檢測

每個標本同時按標準(2 cm×1 cm)涂2張大小、厚度相當的片子待干，火焰固定，染色、熒光顯微鏡下鏡檢。染色方法:將痰液涂片用熒光染色液染10 min，水洗后用3% 的鹽酸酒精脫色1～2 min，至外觀無黃色為止，水洗后加復染劑1～2 min，水洗，晾干。

五、痰培養檢測

痰液以2～3倍體積4%NaOH液化15 min后，3 000×g，離心15 min，小心棄上清，留取底部沉淀;加入 45 mL生理鹽水，震蕩混勻后，3 000×g，離心15 min，小心棄上清，留取底部沉淀;同樣方法，再次洗滌1遍。最后加入1 mL生理鹽水，重懸沉淀，取0.5 mL用于(美國BD公司MGIT 960)液體快速培養。所有培養陽性均經過菌種鑒定，確認為人結核分枝桿菌。

六、熒光定量PCR檢測步驟

1.痰標本消化處理 根據痰液黏稠度加入2～3倍體積的4%NaOH，充分震蕩混勻后，室溫放置15～20 min，待痰液充分液化后，混勻，吸取1.0 mL至1.5 mL的離心管中，用于按照試劑盒說明書進行的DNA抽提。剩余的痰標本用于改進的超聲破碎DNA抽提步驟。

2.試劑盒的DNA抽提步驟(常規法) 液化好的痰液置于4℃低溫離心機中，5 000×g，離心5 min，小心棄上清，留取底部沉淀;加入1 mL生理鹽水，震蕩混勻后，5 000×g，離心5 min，小心棄上清，留取底部沉淀;再加入1 mL生理鹽水，5 000×g，離心5 min，棄上清;加入試劑盒提供的40μL DNA抽提液，充分震蕩混勻;100℃干浴10 min;12 000×g離心10 min后，取上清2μL用于熒光定量PCR檢測。

3.改進超聲破碎法DNA抽提步驟(增量超聲法) 液化好的痰液置于4℃低溫離心機中，3 000×g，離心15 min，小心棄上清，留取底部沉淀;加入45 mL生理鹽水，震蕩混勻后，3 000×g，離心15 min，小心棄上清，留取底部沉淀;加入1 mL生理鹽水，轉入1.5 mL的離心管中，5 000×g，離心5 min，棄上清;加入試劑盒提供的40μL DNA抽提液，充分震蕩混勻;100℃干浴10 min;待標本降至室溫后，放入水浴超聲破碎儀中，300 W功率，超聲破碎15 min。12 000×g離心10 min后和常規提取的DNA標本同時進行熒光定量PCR檢測。

七、統計學方法

分別統計2種不同的處理方法對于結核診斷的敏感性、特異性。采用卡方檢驗比較2組方法的差異性。將定量結果轉換為以2為底的對數值，采用配對T檢驗比較2種方法定量結果之間的差異，并用線性回歸方法對兩者之間的結果進行回歸和相關分析。所有統計采用SPSS 17.0軟件進行計算處理。

結 果

一、增量超聲法顯著提高了結核患者的陽性檢出率

所有結核患者痰培養均陽性，對照組痰培養均為陰性。兩種不同的標本處理方法檢測結核和非結核患者的結果見表1。采用增量超聲法，對于涂片陽性、培養陽性的結核患者，陽性檢出率(敏感性)由 87.5%(可信區間為 81.4% ～93.6%)提升至 95.5%(可信區間為 91.7% ～99.4%)(P ＜0.05)。對于涂片陰性、培養陽性的患者，陽性檢出率由57.4%(可信區間為47.5%～67.4%)提高至 83%(可信區間為75.4% ～90.6%)(P ＜0.01)。2 種方法的特異性均為97.1%，差異無統計學意義(P ＞0.05)。

表1 2種不同的標本處理方法檢測痰液中結核菌DNA的定性結果

二、增量超聲法的定量結果較常規方法有顯著的提高

采用配對T檢驗比較兩者之間定量結果的差異，結果發現增量超聲法的定量結果明顯高于常規方法(P=0.000)，兩者的相關系數為0.900。采用線性回歸擬合兩者的相關方程為:log2(增量超聲法)=1.071×log2(常規法)+3.786。也就是說增量超聲法比常規方法，定量值平均提高14倍以上。圖1為兩者的線性回歸分布圖。

圖1 增量超聲法和常規法定量結果回歸分析圖

討 論

目前我國結核病的診斷的實驗室檢查還是依賴于傳統的細菌涂片和培養。2000年以來，在一些有條件的醫院逐漸開展結核菌的快速培養和基因檢測[6-8]。一般來說抗酸染色涂片檢測結核菌的敏感性在104～105 cfu/mL，濃縮涂片的敏感性可以達到102 cfu/mL[9]。液體培養的敏感性在10～100 cfu/mL。分子生物學的檢測敏感性可以達到10 cfu/mL[10]，也就是說分子診斷的靈敏度和液體培養接近。由于分子診斷具有較高的敏感性和特異性，因此，出現了各種各樣的結核基因診斷檢測方法，如熒光定量PCR檢測結核DNA、等溫擴增檢測結核RNA等。本研究采用國產的熒光定量PCR試劑，采用常規方法，對肺結核的診斷敏感性為73.8%，這個結果和國內一些結核病實驗室的研究報道類似[4]。采用改進的增量超聲破碎法處理標本后，對于肺結核的診斷敏感性提高到了89.8%，基本接近于國際先進的Gene Xpert?MTB/RIF 等產品報道的結果[1，3]。當然，這需要進一步的對比研究才能得出確切的數據。本研究結果表明，增量超聲法CT值較常規方法平均減少3.786，也就是相當于增加14倍的DNA濃度。因此，改進的標本處理方法顯著的提高了診斷的敏感性和定量數值。

分子診斷雖然具有較高的敏感性，但是由于是手工操作，存在交叉污染的可能性，因此其特異性也是一個非常值得關注的問題，本研究結果表明增量超聲破碎法并沒有因為增加了痰液量和超聲破碎的步驟，而導致診斷的特異性下降。

在本研究中，常規方法使用的痰液量僅為0.3～0.5 mL左右，而增量超聲法的痰液量在5～10 mL，相當于前者的10～300倍;也就是相當于有10～300倍的結核菌被用于核酸抽提，充足的結核菌是提高肺結核診斷敏感性的主要原因。另外，常規方法主要采用裂解液和煮沸來破壞結核菌菌體，達到釋放結核菌DNA的效果。而本研究除了采用裂解液裂解和煮沸之外，還增加了國際上公認的最有效的超聲破碎法來進一步提高菌體裂解效果。在實際工作中發現痰液在采用氫氧化鈉液化后，經常會有一些較大、硬的沉淀物殘留。為了保證充分的裂解效果，本研究采用了大功率(300 W)超聲破碎儀，并作用較長的時間(15 min)。大功率、長時間的超聲破碎能夠充分的釋放菌體中的DNA，因而也是診斷敏感性和定量結果提高的另一個重要原因。

國際上有很多提高結核分子診斷敏感性的手段，如采用超聲破碎提取結核菌，采用磁珠純化結核菌DNA，以及采用巢氏PCR來提高PCR檢測的靈敏度。采用磁珠純化等方法純化DNA是一條必然要走的道路，因為痰液直接裂解物中會存在一些雜質，抑制 PCR的反應[5]。國際先進的Gene Xpert?MTB/RIF產品就是采用磁珠純化DNA方法來抽提痰液中結核菌的DNA，在手工操作時由于增加了DNA純化的步驟，無疑增加了試劑成本和檢測產物交叉污染的可能性。巢氏PCR雖然能提高診斷的敏感性，但是采用手工操作時，交叉污染的危險大增，可能會導致較高的假陽性。因此，我們認為其只適合于自動化的儀器操作檢測系統，如 Gene Xpert?MTB/RIF產品。本研究結果表明，通過增加痰液量和超聲破碎提取核酸法，可以明顯的提高結核菌的檢出敏感性和定量結果。這個方法在幾乎沒有增加檢測成本的情況下，達到了較好的檢測效果，在經濟條件有限的國家和地區值得進一步推廣。

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