我國(guó)臨床分子診斷試劑發(fā)展:問題及思考

李金明

(衛(wèi)生部北京醫(yī)院衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心，北京100730)

一提到分子診斷，人們自然會(huì)想到核酸和基因。的確，分子診斷技術(shù)的發(fā)展與分子生物學(xué)的研究是分不開的，自1953年Watson和Crick發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)以來(lái)，一系列分子生物學(xué)新技術(shù)相繼出現(xiàn)，如Sanger測(cè)序、放射性核素和非放射性核素標(biāo)記技術(shù)、電泳、層析、核酸純化、核酸液相和固相雜交、基因工程技術(shù)、限制性酶切、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)、毛細(xì)管電泳、實(shí)時(shí)熒光PCR、基因芯片、質(zhì)譜、新一代測(cè)序等。這些技術(shù)為臨床分子診斷手段的發(fā)展提供了源源不斷的動(dòng)力和無(wú)限的想象空間，并在應(yīng)用中不斷地成熟，使得臨床分子診斷成為檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)最有活力一個(gè)的領(lǐng)域，是當(dāng)今個(gè)體化醫(yī)療迅速發(fā)展的支撐，其具體表現(xiàn)形式就是各種用于特定疾病診斷和治療的臨床分子診斷試劑。

一、歷史

我國(guó)的臨床分子診斷試劑的出現(xiàn)，最早可以回溯到上世紀(jì)80年代，較國(guó)外晚10年左右，當(dāng)時(shí)國(guó)外主要用于遺傳病的診斷，我國(guó)則主要用于乙型肝炎等傳染病的檢測(cè)，這與我國(guó)人群乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)的感染率高，乙型肝炎患者較多是分不開的。那時(shí)，主要是采用硝酸纖維素膜上斑點(diǎn)雜交方法，探針采用32P標(biāo)記，雜交完成后，通過(guò)放射自顯影顯示結(jié)果，后來(lái)，逐步發(fā)展到采用生物素或地高辛等非同位素標(biāo)記。上世紀(jì)90年代以前，在我國(guó)涉及乙型肝炎治療的醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用核酸斑點(diǎn)雜交檢測(cè)HBV DNA相當(dāng)普遍。斑點(diǎn)雜交技術(shù)的特點(diǎn)是簡(jiǎn)單方便，但檢測(cè)敏感性低，今天看來(lái)，將其用于對(duì)檢測(cè)靈敏度要求較高的病原體的檢測(cè)并不合適。1983年，美國(guó)Cetus公司的Mullis發(fā)明了PCR技術(shù)，其利用DNA高溫變性和低溫復(fù)性的基本原理，通過(guò)變性、復(fù)性和延伸3個(gè)溫度變化，成功實(shí)現(xiàn)了DNA在體外的復(fù)制。但該技術(shù)最初由于每一擴(kuò)增循環(huán)均需加入DNA聚合酶(因其不耐熱)，實(shí)際應(yīng)用受到限制，成為PCR應(yīng)用于疾病診斷的瓶頸，隨后幾年，該公司成功從美國(guó)黃石國(guó)家公園溫泉中分離到的嗜熱菌中得到了耐熱的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)，1989年被美國(guó)Science雜志命名第一個(gè)“年度分子”使PCR臨床應(yīng)用的瓶頸問題迎刃而解，從而使得PCR成為臨床分子診斷和生命科學(xué)研究中的一個(gè)革命性技術(shù)，預(yù)示著分子時(shí)代的到來(lái)。因此到90年代初期，國(guó)內(nèi)一批研究人員迅即將這一技術(shù)用于HBV的臨床檢測(cè)，出現(xiàn)一大批生產(chǎn)PCR試劑的公司，采用的基本技術(shù)是PCR-瓊脂糖凝膠電泳方法，靶核酸經(jīng)PCR擴(kuò)增后，會(huì)出現(xiàn)一定長(zhǎng)度片段的特異擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳分離后，經(jīng)溴化乙啶染色，紫外線下可見相應(yīng)的分子大小的條帶。到90年代中期，又有一些廠家，生產(chǎn)了PCR-板上雜交即PCR-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法。但由于PCR-瓊脂糖凝膠電泳和PCR-ELISA均為PCR后有一個(gè)開管取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析的過(guò)程，極容易出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物被“污染”所致的假陽(yáng)性結(jié)果，臨床反映強(qiáng)烈，直接導(dǎo)致1998年4月衛(wèi)生部下文暫停了PCR檢驗(yàn)在臨床中的應(yīng)用。其實(shí)在90年代中期，國(guó)內(nèi)一些企業(yè)已意識(shí)到這種假陽(yáng)性帶來(lái)的問題，開始研發(fā)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑，并用于臨床檢測(cè)。

二、現(xiàn)狀及問題

臨床檢驗(yàn)的發(fā)展方向無(wú)疑是自動(dòng)化，臨床分子診斷亦是如此。自動(dòng)化帶來(lái)了“檢測(cè)系統(tǒng)”的概念，即檢測(cè)儀器、試劑和校準(zhǔn)品的一體化，從而避免了同一試劑在不同實(shí)驗(yàn)室配不同儀器所帶來(lái)的結(jié)果不確定的問題，但由于我國(guó)整體工業(yè)水平(尤其是原材料工業(yè)和精密加工工業(yè))與西方發(fā)達(dá)國(guó)家的差距，在國(guó)產(chǎn)儀器設(shè)備的基礎(chǔ)實(shí)現(xiàn)臨床檢驗(yàn)的自動(dòng)化尚需時(shí)日，臨床分子診斷尤甚。因此，目前我國(guó)的臨床分子診斷在核酸提取、擴(kuò)增反應(yīng)液準(zhǔn)備、擴(kuò)增前加樣、上機(jī)、產(chǎn)物分析和結(jié)果分析報(bào)告等方面仍是以手工操作為主。

分子診斷中繁雜且要求精細(xì)的手工操作步驟，使得臨床實(shí)驗(yàn)室工作人員總在不斷追求操作步驟簡(jiǎn)單的試劑，試劑生產(chǎn)廠家為滿足用戶的這種需求，也在努力追求操作簡(jiǎn)單化，于是一些只需要簡(jiǎn)單核酸提取或不需核酸提取、最少試劑配制的檢測(cè)試劑應(yīng)時(shí)而生。如目前在國(guó)內(nèi)廣泛使用的HBV DNA實(shí)時(shí)熒光PCR試劑。任何一件產(chǎn)品，如果生產(chǎn)過(guò)程只是追求簡(jiǎn)單，則一定會(huì)以質(zhì)量下降為代價(jià)。因此，國(guó)內(nèi)的用于傳染病檢測(cè)的PCR試劑如HBV DNA、丙型肝炎病毒RNA(HCV RNA)和人類免疫缺陷病毒-1 RNA(HIV-1 RNA)定量檢測(cè)，與國(guó)外同類試劑盒相比較，一直存在重復(fù)性、分析敏感性和抗干擾(溶血、黃疸、脂血等)能力差等問題[1-3]。存在這些問題的最根本原因主要在于核酸提取，熒光PCR擴(kuò)增階段的試劑水平與國(guó)外并無(wú)太大差距。臨床標(biāo)本中可能存在血紅蛋白、乳鐵蛋白、免疫球蛋白G(IgG)、膽紅素、血脂等均是PCR擴(kuò)增反應(yīng)的抑制劑，是否能有效地將這些抑制物從標(biāo)本中去除，決定了后續(xù)的PCR擴(kuò)增效率。核酸提取方法過(guò)于簡(jiǎn)單，則無(wú)法將這些抑制物有效去除，直接影響后面的擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果，影響上述檢測(cè)性能。而且，也因?yàn)檫@些抑制物的存在，無(wú)法在擴(kuò)增檢測(cè)時(shí)加大樣本加入量。樣本加入量小，一是加樣的重復(fù)性和準(zhǔn)確性都相對(duì)較差，最后會(huì)反映在整個(gè)檢測(cè)的重復(fù)性差;二是直接影響分析敏感性。作為PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)，從理論上講，每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)至少有1個(gè)分子，才會(huì)出現(xiàn)擴(kuò)增，加樣量少，在標(biāo)本內(nèi)相應(yīng)靶核酸含量少的情況下，則取得1個(gè)以上靶分子的可能性也小，反之越大。相對(duì)于傳染性病原體核酸檢測(cè)來(lái)說(shuō)，人的基因檢測(cè)試劑在上述方面問題相對(duì)較少，因?yàn)槿说幕蚝扛?，一般不存在因?biāo)本中基因組含量少而影響檢測(cè)敏感性的問題，通常的核酸提取方法均可達(dá)到相應(yīng)要求。

近年來(lái)，隨著藥物基因組學(xué)和腫瘤靶向治療等的研究進(jìn)展，與個(gè)體化治療用藥相關(guān)的基因多態(tài)性、基因突變和基因量的變化等的檢測(cè)正迅速走向臨床應(yīng)用。國(guó)內(nèi)眾多廠家正在采用各種方法開發(fā)商品試劑，如基于實(shí)時(shí)熒光PCR的方法、PCR-雜交(硝酸纖維素膜、乳膠顆粒如Luminex、玻片如基因芯片等)、PCR-測(cè)序(雙脫氧測(cè)序、焦磷酸測(cè)序、新一代測(cè)序如Illumina、Ion torrent等)和PCR-高分辨熔點(diǎn)曲線分析(HRM)等，技術(shù)多種多樣，各有特點(diǎn)，有的對(duì)實(shí)驗(yàn)室分區(qū)和操作人員的要求較高，對(duì)廣大基層實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)，較難實(shí)際應(yīng)用。因此，作為臨床實(shí)驗(yàn)室如何判斷一種試劑方法能否有效地用于日常檢測(cè)，最重要的是在自己實(shí)驗(yàn)室條件，對(duì)相應(yīng)的試劑方法進(jìn)行性能驗(yàn)證，主要的性能指標(biāo)有重復(fù)性、準(zhǔn)確性、特異性、檢測(cè)限和抗干擾能力等，這些性能指標(biāo)中最重要的是重復(fù)性，其是準(zhǔn)確性的前提。評(píng)價(jià)重復(fù)性的1個(gè)簡(jiǎn)單方法是，選擇不同強(qiáng)弱陽(yáng)性及陰性的數(shù)份樣本進(jìn)行20次批內(nèi)和批間測(cè)定，看是否能得到相同的結(jié)果。如否，需尋找原因，排除實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件及人員操作的因素，如果確認(rèn)屬于試劑或方法的問題，則該試劑或方法就不具備臨床實(shí)用性，不能用于臨床檢測(cè)。

三、展望

隨著對(duì)人類基因及其結(jié)構(gòu)改變、基因表達(dá)或表達(dá)產(chǎn)物代謝異常與疾病的發(fā)生、發(fā)展和藥物作用上的研究進(jìn)展，分子診斷不只是涉及DNA和RNA，也涉及蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)檢測(cè)。檢測(cè)方法學(xué)的進(jìn)步，使得因疾病而改變的基因及其結(jié)構(gòu)改變的譜、基因表達(dá)譜(RNA和蛋白譜)、代謝通路上的小分子譜的檢測(cè)變得容易，將出現(xiàn)一大批可用于臨床疾病診治的分子診斷標(biāo)志物，使人類對(duì)疾病的認(rèn)識(shí)，由點(diǎn)入面，最后得到1個(gè)清晰的全景圖像，治療成為有的放矢，使得患者疾病的治療進(jìn)入到真正的個(gè)體化時(shí)代。由上述可見，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)尤其是分子診斷的準(zhǔn)確性對(duì)于個(gè)體化醫(yī)學(xué)時(shí)代患者疾病的診治的重要意義。

1.方法學(xué)的更新?lián)Q代 盡管在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)上發(fā)表的分子診斷方法很多，并且還在不斷出現(xiàn)，也有不少人嘗試將用于臨床診斷，但隨著時(shí)間的推移，一些在臨床實(shí)際檢測(cè)中證明重復(fù)性不好的只適用于科研的方法，將會(huì)被完全淘汰。有些方法，在對(duì)操作者有嚴(yán)格訓(xùn)練的情況下，可得到好的重復(fù)性，但很難廣為推廣應(yīng)用，只適用于個(gè)別實(shí)驗(yàn)室自配試劑使用。適用于廣大基層臨床實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)方法，通常應(yīng)具備以下特征:(1)對(duì)實(shí)驗(yàn)室的分區(qū)要求低;(2)對(duì)人員的操作的精確度要求不高;(3)結(jié)果分析簡(jiǎn)單。

2.商品試劑與實(shí)驗(yàn)室自配試劑 我國(guó)的臨床檢驗(yàn)由完全的自配試劑進(jìn)行日常檢測(cè)進(jìn)入到依賴商品試劑盒，是從上世紀(jì)80年代末開始的，到90年代中后期，實(shí)驗(yàn)室基本不再使用自配試劑。分子診斷不同于臨檢、生化、一般免疫分析等，其日常檢測(cè)量明顯較少，且一些特定的檢測(cè)項(xiàng)目如遺傳病和罕見疾病的分子診斷，病例數(shù)更少，這些疾病的分子診斷試劑是永遠(yuǎn)也不可能有經(jīng)過(guò)批準(zhǔn)的商品試劑盒的，因此，就必須允許臨床實(shí)驗(yàn)室自配試劑進(jìn)行檢測(cè)。最重要的是，如果是自配試劑必須有自配試劑的標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)，包括從原材料選擇及其每批質(zhì)檢、試劑配制、試劑的性能驗(yàn)證(重復(fù)性、準(zhǔn)確性、特異性、檢測(cè)下限、抗干擾能力等)、每批試劑質(zhì)檢方法等，最后形成的應(yīng)是一個(gè)非商品試劑盒，從內(nèi)到外應(yīng)有商品試劑盒所具備的所有必要成分，并標(biāo)明有效期。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保存該試劑制備的所有原材料購(gòu)置、質(zhì)檢和制備的實(shí)驗(yàn)記錄。用于日常檢測(cè)時(shí)，應(yīng)有嚴(yán)格的室內(nèi)質(zhì)量控制，如有室間質(zhì)量評(píng)價(jià)，則應(yīng)參加，如無(wú)，則應(yīng)有實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)，以保證日常檢驗(yàn)的質(zhì)量。

3.實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的自動(dòng)化 隨著我國(guó)基礎(chǔ)工業(yè)的進(jìn)步及下游工業(yè)的全球化，臨床分子診斷的自動(dòng)化將逐步在國(guó)內(nèi)的臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。自動(dòng)化首先將是在目前手工操作且對(duì)結(jié)果影響最大的核酸提取上實(shí)現(xiàn)，然后是結(jié)果的分析判斷，這方面軟件將起到最為關(guān)鍵的作用。當(dāng)然最終目標(biāo)，是實(shí)現(xiàn)從核酸提取到擴(kuò)增檢測(cè)、結(jié)果報(bào)告全過(guò)程的自動(dòng)化，國(guó)外一些廠家如羅氏、凱杰已實(shí)現(xiàn)了這一點(diǎn)，但對(duì)于國(guó)內(nèi)企業(yè)來(lái)說(shuō)，仍需要一個(gè)相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。

[1]李金明.乙型和丙型肝炎病毒感染檢測(cè)試劑的標(biāo)準(zhǔn)化:問題與對(duì)策[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010，33(10):901-904.

[2]吳 星，周 誠(chéng)，梁爭(zhēng)論.國(guó)內(nèi)外肝炎病毒核酸定量和定性檢測(cè)試劑的差異及質(zhì)量控制[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010，33(10):905-908.

[3]魏 來(lái)，楊瑞鋒.丙型肝炎病毒實(shí)驗(yàn)室診斷的現(xiàn)狀與存在的問題[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2008，31(8):845-848.