ALOX12基因多態性與糖尿病和糖尿病腎病的相關性研究

李 頎，王 巖，邱一凡，董 玲，陳克林

(大慶油田總醫院中心實驗室，黑龍江大慶163001)

2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)，是一種常見的多因子的代謝病，其發病原因是由環境和遺傳因素共同作用。在不同種族人群中，T2DM的發病率都在持續增長，影響到各個年齡段的人群[1-2]。基因學的研究一致認為糖尿病是一個家族性的疾病。雖然目前對糖尿病有較多的全基因組范圍關聯研究(genome-wide association studies，GWAS)，T2DM 的易感基因還是不清楚[3-13]。

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見的微血管并發癥。DN引發的終末期腎病(ESRD)已成為威脅糖尿病患者生命的主要原因。DN是造成1型糖尿病和T2DM致死的主要原因[14]。DN的發生發展受環境和遺傳因素的協同作用。

ALOX12是脂氧合酶超家族成員之一，在有氧條件下，催化多不飽和脂肪酸底物(包括花生四烯酸和亞油酸)形成氫基二十碳四烯酸(hydroxyeicosatetraenoic acid，HETE)。ALOX12基因位于染色體17p13.1，由14個外顯子和13個內含子組成[15-16]。根據該基因的功能推測其與糖尿病的發生有關，這一觀點也被研究證實[15，17-18]。在歐美人群中開展的研究已發現ALOX12基因多態性與T2DM易感性之間存在相關性[17]，ALOX12基因R261Q位點的突變會顯著增加DN蛋白尿癥的發病風險[15]。

盡管ALOX12基因與T2DM的關系已有研究，但是關于漢族人群的該基因在T2DM發病風險中的作用至今未見報道。T2DM以及DN在中國人群的發病率中占有很大比例，因此研究ALOX12基因與DN的關系具有十分重要的理論和實踐意義。Burdon等[19]研究發現，一種ALOX12基因的編碼突變會導致氨基酸261位置上1個精氨酸被谷氨酸替代(Arg261Gln)，該位點為 rs1126667，位于ALOX12基因6號外顯子上。我們選取這一位點作為研究對象，探討ALOX12基因多態性與中國漢族人群T2DM腎病易感性關系。

材料和方法

一、對象

采用病例-對照的方法。研究對象共343例，分為病例組和正常對照組。其中病例組為223例T2DM患者，均按照世界衛生組織(WHO)1999年公布的和2003年國際糖尿病專家委員會建議的標準診斷[20]。該組又分為2個亞組:(1)DN組134例，男75例，女59例，DN診斷標準為持續蛋白尿，間隔1個月以上連續測定尿蛋白，尿中白蛋白排泄率＞300 mg/24 h，或糖尿病合并腎功能不全，并排除由心臟、肝臟及其他全身疾病引起蛋白尿、原發泌尿系統疾病和應用影響腎功能藥物者;(2)T2DM無腎病組89例，男52例，女37例，尿中白蛋白排泄率＜30 mg/24 h。正常對照組為120名健康人，男61名，女59名。研究對象均屬于東北漢族人群，病例組選自東北地區大慶油田總醫院內分泌科住院患者。正常對照組為大慶油田總醫院同期健康體檢人員120名，無糖尿病、高血壓和腎病家族史，在年齡選擇上與糖尿病病例組相一致。所有受檢者相互間無血緣關系，抽血前簽署知情同意書，填寫一般資料調查表。

二、DNA 的提取

樣本為外周血2 mL。用DNA提取試劑盒(天根生物技術有限公司，TIANamp Genomic DNA Kit)提取 DNA(按說明書操作)，DNA保存于－70℃備用。

三、引物設計

從Hapmap數據庫上的標簽SNP中選擇ALOX12基因Arg261Gln上1個位點rs1126667。

根據ALOX12基因的目標序列和所選擇的多態性位點，利用Sequenom MassARRAY Assay Design 3.0軟件設計這個位點的多重PCR特異性擴增引物和延伸引物。引物序列見表1。

表1 ALOX12基因rs1126667位點引物序列

五、基因分型分析

提取純化后的基因組DNA樣品濃度A260nm/A280nm比值為1.7 ～1.9，按設計順序加樣于384 孔板上，然后加PCR擴增體系使反應物的終濃度如下:Taq聚合酶0.1 U，基因組 DNA 5 ng，PCR 引物 2.5 pmol，dNTP 2.5 mmol。PCR 反應條件:95℃ 15 min，然后45個循環的95℃ 20 s、56℃30 s、72℃ 30 s。剩余的dNTP經添加0.3 U的堿性磷酸酶去除。單堿基延伸反應通過添加5.4 pmol延伸引物，50 μmol dNTP/ddNTP 混合物，0.5 U Thermosequenase DNA 聚合酶，反應條件為94℃ 2 min，然后94℃ 5 s、50 ℃ 5 s、72 ℃5 s 40個循環。反應產物用樹脂脫鹽20min后經自動點樣儀點樣于SpectroCHIP(Sequenom)芯片。點樣后的芯片用基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜(SpectroREADER，Sequenom)檢測。ALOX12基因rs1126667 SNP 3種基因型圖譜見圖1。

圖1 ALOX12 rs1126667位點3種基因型圖譜

六、統計學方法

對基因型分布頻率進行Hardy-Weinberg平衡檢驗。采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，采用Logisitic回歸以消除年齡對統計的影響。數據采用SPSS 13.0軟件分析和互聯網上的 SNPstats(http://bioinfo.iconcologia.net/SNPstats)進行分析[21]。

結 果

一、各組一般臨床資料和檢測結果比較

正常對照的性別構成與病例組相匹配。正常對照組和DN組性別構成、身高、體重指數(BMI)及膽固醇差異均無統計學意義(P＞0.05)。

與正常對照組相比，DN組年齡、體重、血壓、尿素氮、空腹血糖、肌酐、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇及低密度脂蛋白膽固醇差異均有統計學意義(P ＜0.01、P ＜0.05);T2DM 無腎病組年齡、體重、舒張壓、尿素、空腹血糖、甘油三酯及低密度脂蛋白膽固醇差異均有統計學意義(P＜0.01)。見表2。

二、各組ALOX12基因rs1126667位點基因型分析

T2DM組和正常對照組ALOX12基因rs1126667位點的等位基因頻率分布見表3。正常對照組和T2DM組等位基因頻率差異無統計學意義(P ＞0.05)。

表2 各組一般情況比較 (±s)

表2 各組一般情況比較 (±s)

注:與正常對照組比較，*P ＜0.05、＊＊P ＜0.01;與 DN 組比較，#P ＜0.01;△表示自然對數

組別 例數 性別(男/女)年齡(歲) 身高(cm) 體重(kg) 收縮血壓(kPa) 舒張血壓(kPa)正常對照組 120 61/59 52.8 ±6.4 165.93 ±7.69 64.55 ±9.86 15.70 ±1.60 10.50 ±1.06 DN 組 134 75/59 59.3 ±12.4 166.79 ±7.50 70.93 ±15.34＊＊ 19.20 ±4.52＊＊ 11.00 ±1.89＊＊T2DM 無腎病組 89 52/37 56.8 ±11.8 166.83 ±7.73 69.77 ±11.56＊＊ 19.20 ±3.32＊＊ 10.71 ±1.48組別 例數 BMI(kg/m2) 血清尿素(mmol/L) 空腹血糖(mmol/L) 餐后2 h血糖(mmol/L)120 23.45 ±1.23 5.26 ±1.16 4.8 ±0.48 5.71 ±1.18 DN 組 134 25.50 ±2.89＊＊ 11.71 ±8.71＊＊# 10.79 ±4.52＊＊ 14.56 ±5.31＊＊T2DM 無腎病組 89 25.07±1.62＊＊ 6.52±2.12＊＊# 9.48±3.8＊＊ 13.93±4.63＊＊組別 例數 糖化血紅蛋白(%) 肌酐(μmol/L)△ 膽固醇(mmol/L)△ 甘油三酯(mmol/L)正常對照組△正常對照組 120 5.24 ±0.50 4.16 ±1.50 1.58 ±0.19 0.47 ±0.097 DN 組 134 7.69 ±0.20＊＊ 5.28 ±1.67＊＊ 1.68 ±0.32 0.98 ±0.072＊＊T2DM 無腎病組 89 8.5 ±1.26＊＊# 4.14 ±1.22# 2.04 ±1.21# 0.95 ±0.039＊＊#組別 例數 高密度脂蛋白膽固醇(mmol/L)△低密度脂蛋白膽固醇(mmol/L)△ C肽(nmol/L)# 胰島素(pmol/L)△正常對照組 120 0.27 ±0.013 0.97 ±0.06 0.49 ±0.10 3.26 ±0.23糖尿病腎病組 134 0.13±0.039＊＊ 1.01±0.320* 1.2±0.160＊＊ 5.25±1.50*2 型糖尿病無腎病組 89 0.19 ±0.028*# 1.13 ±0.240＊＊# 1.03 ±1.00＊＊ 4.53 ±1.54*#

表3 正常對照組與T2DM組rs1126667位點等位基因頻率分布 [例(%)]

對ALOX12基因的rs1126667位點行Hardy-Weinberg平衡檢驗，然后行χ2檢驗。如果位點在對照組中不符合Hardy-Weinberg平衡，我們通常會懷疑該位點的基因型鑒定的質量;如果該位點在對照組平衡而在病例組出現不平衡，則該位點很可能和疾病有關。T2DM組和正常對照組ALOX12基因rs1126667位點等位基因型頻率和Hardy-Weinberg平衡檢驗結果見表4。結果顯示該位點符合Hardy-Weinberg平衡定律，樣本基因型檢測結果經Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗，具有群體代表性(P＞0.05)。

三、各組Logistic回歸分析

運用廣義模型，對rs1126667位點進行Logistic回歸分析，對年齡和性別做了校正后，計算相對危險度[OR(95%CI)]。結果顯示T2DM組、DN組、T2DM無腎病組與正常對照組之間OR值差異無統計學意義(P＞0.05)，見表5。T2DM無腎病組與T2DM組差異無統計學意義(P＞0.05)，結果見表 6。

表4 正常對照組與T2DM組rs1126667位點基因型分布 [例(%)]

表5 正常對照組與T2DM組rs1126667位點與疾病的相關度(校正年齡和性別) [OR(95%CI)]

表6 T2DM無腎病組及DN組rs1126667位點與疾病相關度(校正年齡和性別)

討 論

T2DM是一種具有明顯遺傳傾向的多基因疾病，其發病機制十分復雜，是由遺傳、環境、行為多種因素共同參與、相互作用促成發生的一種多因子代謝病。

ALOX12是脂氧合酶超家族成員之一，在有氧條件下，催化多不飽和脂肪酸底物(包括花生四烯酸和亞油酸)形成氫基二十碳四烯酸(hydroxyeicosatetraenoic acid，HETE)。研究表明，多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)能通過改變細胞膜成分、細胞內鈣離子水平以及花生酸產物進而影響調控脂代謝基因的表達，同時PUFAs及其代謝產物還可以通過結合不同的細胞核受體及轉錄因子影響基因轉錄。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferatoractivated receptor，PPAR)是一種細胞核受體，已知有3種類型。已經被證實能夠與PUFAs及其代謝產物相互作用，并在調控脂代謝相關基因表達中起重要作用[22]。其中過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)是重要的條件脂聯素和胰島素敏感、脂肪酸代謝的調節因子，在脂肪細胞分化、肥胖易感性和胰島素抵抗中起重要的作用[18，23]。與其功能相近的基因在此方面已經有類似的研究[24-25]。根據該基因的功能推測其與糖尿病的發生有關，這一觀點也被研究證實。在歐美人群中開展的研究已發現ALOX12基因多態性與 T2DM易感性之間存在相關性[17]，ALOX12基因Arg261Gln位點的突變會顯著增加DN蛋白尿癥的發病風險，其多態性與歐美人群DN的發病機理密切相關[15]。

ALOX12基因位于染色體17p13.1，由14個外顯子和 13 個內含子組成[15]。Burdon 等[19]研究發現，一種 ALOX12基因的編碼，位點為rs1126667，位于ALOX12基因6號外顯子上，當G轉換成A時，會導致氨基酸261位置上1個精氨酸被谷氨酸替代(Arg261Gln)。本實驗選取這一位點作為研究對象，探討ALOX12基因多態性與中國漢族人群T2DM腎病易感性關系。

ALOX12基因與DN的關系已經在動物模型實驗以及人體實驗中被證實。動物模型中一系列研究數據表明，脂氧合酶12(12-lipoxygenase，12LO)與高血糖癥引起的腎病密切相關[26]。當小鼠腎小球系膜細胞和腎小囊臟層細胞置于高濃度葡萄糖溶液環境中，12LO mRNA轉錄水平和蛋白水平含量激增。激增的12LO和HETE能夠誘導腎臟組織細胞肥大以及腎小球系膜細胞外纖連蛋白的表達[26-28]。而DN與腎小球系膜細胞的增厚、腎小球細胞的肥大以及腎小球系膜細胞外基質的沉積有關[14]。由此推測12LO與DN的發生有關。人體中的花生四烯酸 12-脂氧合酶ALOX12和動物的12LO結構功能相似，可能參與DN的致病機理。Meirhaeghe等[23]研究證實在不同種族人群 PPAR-γ基因多態性(最常見為Pro12Ala)與T2DM易感性相關。而ALOX12的催化底物(花生四烯酸、亞油酸)及其催化產物是PPAR內源性配體，由此推測 ALOX12基因與T2DM的發病有關。Liu等[15]在研究ALOX12與T2DM蛋白尿癥的血糖控制關系中發現，ALOX12基因p.Arg261Gln位點的突變會顯著增加糖尿病腎病蛋白尿癥的發病風險;ALOX12基因多態性與歐美人群的DN發病機理關系密切。然而該位點的突變與DN的確切關系還需要進一步的實驗證明。

本研究探討了東北漢族人群中ALOX12基因的rs1126667位點多態性與T2DM和DN的關聯性。研究發現該基因的rs1126667位點多態性和T2DM及DN不相關。而Kasinath等[29]在歐美人群中的研究中發現，ALOX12基因多態性與T2DM存在相關性。這種不一致性可能是由于種群與地理位置不同造成。不同地區的人種群具有不同的發展歷史。所以采用不同的人群進行研究，得到的結果可能不同。另外，對于ALOX12基因多態性與糖尿病的相關性研究主要集中在 rs1126667位點，可能也會出現在其它位點對該基因與疾病相關性的研究。后續研究中需要擴大該基因的研究位點，同時可選取更大的范圍，擴大樣本數量進行進一步研究。

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